Е. Каудри, «Раковые клетки»
Под ред. проф. В. В. Алпатова и др.,
Издательство иностранной литературы, М., 1958 г. OCR Wincancer.Ru Приведено с некоторыми сокращениями
Ценные данные об этих органоидах можно почерпнуть из трудов симпозиума по митохондриям, который был организован Новиковым (1953). Особый интерес представляет оживленная дискуссия, развернувшаяся после докладов. Митохондрии — это цитоплазматические структуры, содержащиеся во всех живых клетках, начиная от одноклеточных организмов и кончая клетками человека. Митохондрии играют важнейшую роль в различных жизненных функциях, число которых слишком велико, чтобы их здесь перечислять. Не удивительно поэтому, что были сделаны многочисленные попытки обнаружить существенные различия между митохондриями злокачественных и нормальных клеток.
Прежде всего были предприняты попытки обнаружить эти различия при помощи микроскопического исследования окрашенных срезов фиксированных тканей. Обзор старых работ можно найти и статьях Каудри (1918, 1926). Во многих работах детальное описание обнаруженных изменений сопровождается цветными иллюстрациями, качество которых значительно лучше, чем качество иллюстраций в статьях современных патологов. В этих исследованиях были изучены митохондрии клеток самых различных типов злокачественных опухолей. Поэтому любой исследователь, который в наши дни хочет дать описание своих собственных наблюдений, касающихся митохондрий, должен прежде всего убедиться в отсутствии еще лучших описаний в одном из старых номеров общеизвестных медицинских журналов.
Из этих старых работ ясно, что между митохондриями некоторых злокачественных и некоторых нормальных клеток имеются определенные различия в отношении их величины, формы, числа и расположения в цитоплазме. Однако такие сравнения часто были непрямыми, так как редко сравнивали злокачественные клетки и их нормальные прототипы в наиболее близких условиях опыта; кроме того, значительные вариации митохондрий отмечались в злокачественных клетках, взятых из различных участков одной и той же опухоли. Одним из наиболее закономерно наблюдавшихся изменений было значительное увеличение митохондрий в клетках токсических аденом щитовидной железы по сравнению с клетками нормальных щитовидных желез (Готч, 1916). Причина этого явления до сих пор неизвестна.
Рядом исследований было показано, что митохондрии чрезвычайно чувствительны к одним видам травмы и нечувствительны к другим. Обычно под влиянием повреждений число митохондрий уменьшается и утрачивается их нитевидная форма. Нередко также наблюдается образование тяжей и круглых капелек. В литературе не описано обратное явление, т. е. образование нитевидных митохондрий из зернистых под влиянием повреждающих воздействий. Расположение митохондрий в цитоплазме также подвержено изменениям; они могут концентрироваться в периферических участках протоплазмы или вокруг ядра. Однако при многих исследованных патологических процессах, в том числе в различных доброкачественных и злокачественных опухолях, не удалось обнаружить каких-либо общих факторов, определяющих изменения формы, числа и расположения митохондрий.
Естественно, что внимание исследователей привлек метод культуры ткани, так как, используя этот метод, можно регулировать и идентифицировать состав жидкой среды нормальных и злокачественных клеток. Нередко в одной и той же клетке удается видеть все формы митохондриальных нитей, разветвленные тяжи и гранулы, причем диаметр всех этих образований часто бывает одинаковым.
Результаты этих исследований следует считать более точными, однако и они не могли быть истолкованы надлежащим образом, так как природа самих митохондрий оставалась неизвестной. На долгие годы изучение митохондрий стало непопулярным, так как оно казалось совершенно безрезультатным. Только в 1934 г. началось эффективное изучение митохондрий. Началом этих исследований послужила работа Бенсли и Хёрра, показавших, что митохондрии могут быть выделены из живых клеток и исследованы непосредственно. Короче говоря, новая методика состояла в том, что клетки печени разрушали, содержимое промывали физиологическим солевым раствором и путем центрофугирования выделяли en masse в условиях, подходящих для химического анализа. Как уже указывалось, работа Бенсли и Хёрра оживила изучение митохондрий и позволила сделать эти исследования непосредственными. Все это оправдывает разделение истории изучения митохондрий на два периода: до Бенсли и после Бенсли.
«Оглядываясь назад, мы можем только удивляться, как много фактов, касающихся митохондрий, было открыто старыми исследователями. Они установили следующее: 1) митохондрии являются основными компонентами клетки, столь же характерными для цитоплазмы, как хроматин для ядра; 2) они обладают очень большой поверхностью взаимодействия с цитоплазмой; 3) они состоят из липопротеидов и 4) являются центрами обмена веществ - настоящими маленькими заводами, производящими многочисленные продукты, необходимые для жизни» (Каудри, 1953а).
В статье Шнейдера (1953) содержится критический обзор методических усовершенствований, а также тщательных исследований, проведенных различными авторами, которые значительно расширяли наши знания по этому вопросу. Шнейдер составил таблицу, в которой перечисляются все известные химические составные части изолированных митохондрий печени. Шнейдер суммировал также данные о ферментативных функциях изолированных митохондрий. Шнейдер и Ходжбум (1951) пытались доказать, что цитохромоксидаза локализуется исключительно в митохондриях и что митохондрии содержат всю сукциноксидазную активность печеночных клеток. Однако это и другие
сообщения, касающиеся изолированных митохондрий, не всегда принимаются всеми исследователями без возражений. Некоторые основания имеет точка зрения, высказанная Ньюкомером.
Работа Линдберга и сотр. (1953), посвященная изучению ферментативных свойств изолированных митохондрий, интересна тем, что в ней в качестве источника опухолевых клеток была использована асцитная опухоль Эрлиха. Работа с этой опухолью представляет определенное удобство, так как в ней содержится очень высокий процент злокачественных клеток без примеси клеток стромы, которые неизбежно присутствуют в ткани гепатомы. Авторы показали, что митохондрии, изолированные из злокачественных клеток, могут окислять субстраты цикла Кребса и осуществлять сопряженное фосфорилирование. Однако асцитная опухоль обладает и одним существенным недостатком. Свойства митохондрий из клеток опухоли Эрлиха или любой другой асцитной опухоли труднее сравнивать со свойствами митохондрий, изолированных из нормальных клеток-прототипов; такое сравнение легче провести при сопоставлении свойств митохондрий из клеток гепатомы и из клеток нормальной печени.
Выступая в прениях на упомянутом выше симпозиуме, Ньюкомер довольно резко критиковал методику, применяемую для изучения митохондрий. «В работах, доложенных на нашем симпозиуме, кратко указывалось, что нужно быть осторожным при использовании в цитологии метода мацерации и центрифугирования тканей. Такая позиция «неустойчивой уверенности» в методике в настоящее время не кажется мне оправданной, так как при применении этой методики были получены противоречивые результаты, как это видно из сообщений, сделанных на нашем симпозиуме, а также и из других работ. Даунс уже предостерегал относительно недостатков данной методики. Каудри, Циркль, Опи, Чемберс и другие доказали сложность структуры митохондрий и их чувствительность к травмам. Даниелли пошел еще дальше и отрицал ценность всего данного направления исследований, названного им «цитологией кашицы». Насколько мне известно, только Шнейдер, Ходжбум и Палэйд показали морфологически, что во фракции мацорированных и центрифугированных животных клеток содержатся митохондрии.
В опытах с растительными клетками это еще не было доказано. Пока это очевидное и элементарное условие не будет полностью выполнено, неверно, а может быть, даже вредно, пытаться точно определять функцию митохондрий. Ведь форма связана с функцией, и морфологические изменения составных частей клетки вызывают изменения функциональной активности. Если из митохондрий не удается сделать мазок, то надо исследовать, как и почему эти митохондрии остаются живыми после гомогенизации ткани.
Дальнейший анализ этой методики позволяет предположить, что исследователи, пользующиеся ею, принимают во внимание не только возможные нарушения взаимоотношений между клетками в процессе гомогенизации, но и возможность создания или разрушения при этом физических или химических комплексов. Все детали методики в том ее виде, как ею обычно пользуются на практике, увеличивают возможность случайной диффузии или образования артефактов в результате адсорбции. Однако, несмотря на все эти недостатки, данная методика или какие-то ее модификации обещают в будущем очень много, если только мы научимся преодолевать трудности, встречающиеся при ео использовании.
История изучения митохондрий сохранила много примеров скороспелых выводов; лишь в немногих областях науки делалось так много необоснованных обобщений. Немалую роль сыграли в этом артефакты. Несмотря на все это, мы уже достигли некоторого прогресса. Если при изучении митохондрий в течение всего исследования будут применяться точно разработанные методы контроля, то мы можем в будущем получить ценные данные о функциях этих структур. Если этот призыв не будет слишком запоздалым, то следует признать желательным, чтобы цитолог и биохимик, хотя бы время от времени, работали совместно. При этом цитолог мог бы по крайней мере убедиться, что в этих исследованиях должное внимание уделяется таким старомодным принципам, как гомология и аналогия».
Существуют и другие важные соображения, которые нужно иметь в виду, если мы хотим правильно оценить данные, касающиеся митохондрий. Данные, приведенные в табл., относятся только к митохондриям, изолированным из печени, так как именно печень удобнее всего изучать при помощи данной методики. Печень имеет еще и то преимущество, что большинство ее клеток принадлежит к одному и тому же типу, хотя эти клетки и способны выполнять самые различные функции, поскольку печень в нашем организме является «мастером на все руки». Вероятно, в режиме питания отдельных животных, на которых ставился опыт, не было больших вариаций. Однако было бы желательным повысить однородность изучавшейся ткани, заставляя животных голодать в течение строго определенного промежутка времени перед взятием ткани для химического исследования.
Химические компоненты митохондрий клеток других типов могут быть в основном сходными с соответствующими компонентами печеночных клеток. Однако различные клетки могут быть по-разному специализированы, причем в такой специализации, вероятно, участвуют и митохондрии. Изменения химического состава и ферментативной активности митохондрий в процессе гистогенеза должны быть изучены в будущем при помощи этих новых методов. Можно с уверенностью сказать, что они будут варьировать сильнее, чем соответствующие свойства митохондрий из зрелых тканей.
В табл. представлены результаты сравнения митохондрий нормальных и злокачественных клеток при микроскопическом изучении срезов и при изоляции митохондрий по методу Бенсли — Хёрра в различных его модификациях. Как видпо из этой таблицы, различные авторы наблюдали как увеличение, так и уменьшение содержания митохондрий в злокачественных клетках по сравнению с их нормальными прототипами. Насколько эти изменения соответствуют истинным изменениям на единицу объема цитоплазмы, остается неясным. Лишь в немногих работах авторы пытались внести поправки на изменение объема клеток и ядерно-цитоплазматического отношения. Были разработаны методы, при помощи которых в гомогенатах, представляющих собой суспензии митохондрий, можно определить число митохондрий, а также других частиц, подвергаемых анализу (Аллард, Матье и сотр., 1952; Шелтон, Шнейдер и Штрибих, 1953). В опытах следует использовать именно такие гомогенаты. Особое значение имеет 3—5-кратное уменьшение удельной активности сукциноксидазы, аденозинтрифосфатазы и цитохромоксидазы в митохондриях гепатомы.
Гетерогенность митохондрий в гомогенатах общепризнана. Различия в форме и величине митохондрий выявляются еще отчетливее как в живых, так и в фиксированных и окрашенных клетках иечени. В опытах с гомогенатами исследователи пытались выяснить отношения между формой митохондрий, с одной стороны, и их химическим составом и активностью — с другой. Достаточно сослаться на работу Хармана и Фигельсона (1952), в которой объектом исследования служила мышца сердца. Следует упомянуть также о старых работах, посвященных гистогенезу и дифференцировке клеток, обзор которых был сделан Каудри (1918). В этих работах во многих случаях были установлены топографические отношения между различными формами митохондрий и образованием тех или иных веществ.
Весьма желательно более детально изучить структуру и поведение митохондрий в живых клетках. Самой высокой похвалы заслуживает кинематографическое исследование митохондрий в культуре ткани, проведенное В. Льюисом и одним из его студентов — Дж. Геем. На симпозиуме, посвященном митохондриям, Гей продемонстрировал превосходный кинофильм. К сожалению, кадры из этого фильма до сих пор не опубликованы.
При помощи этого метода можно в течение многих часов наблюдать все формы митохондрий и изучать их поведение. Некоторые митохондрии перемещаются в цитоплазме на относительно большие расстояния, тогда как соседние митохондрии остаются неподвижными. Предположение о том, что митохондрии способны передвигаться самостоятельно, не подтвердилось. Вероятно, они переносятся тонкими и невидимыми даже под микроскопом токами цитоплазмы. Нет никаких данных, доказывающих, что митохондрии, подобно подвижным микроорганизмам, имеют жгутики или другие структуры, позволяющие им передвигаться самостоятельно. Если бы такие специализированные структуры существовали, то они, вероятно, были бы выявлены при применении специальных методов импрегнации серебром или при электронной микроскопии. При просмотре кинофильмов легко получить преувеличенное представление о движениях митохондрий. Следует помнить, что в этих фильмах расстояния резко увеличены и все движения ускорены в результате проекции фотографий, сделанных через довольно большие интервалы.
Несомненно, возможность непрерывного наблюдения за митохондриями нормальных и злокачественных клеток при помощи кинематографического метода открывает путь для весьма плодотворных исследований. Состав жидкостей, в которых культивируются клетки, можно изменить в желаемую сторону.
Известно, что фибробласты и эпителиальные клетки способны превращаться в злокачественные клетки как спонтанно (в редких случаях), так и в результате воздействия химическими канцерогенными веществами (Эрл, 1943; Дж. Гей и сотр., 1949). Эрл и сотр. разработали метод выращивания столь больших культур тканей, что из них можно изолировать митохондрии и подвергать их химическому исследованию, как это делается с митохондриями из нормальных органов и опухолей. Такое химическое исследование митохондрий из культуры ткани может оказаться новым шагом вперед в изучении этой проблемы.
Фазово-контрастный микроскоп позволяет наблюдать детали структуры живых клеток, которые остаются невидимыми в обычном микроскопе. Так, при помощи фазово-контрастного микроскопа можно отчетливо видеть центриоли, которые в других случаях остаются незамеченными. При помощи этого метода в клетках саркомы цитоплазматические и ядерные структуры выявляются чрезвычайно четко, как это показывает работа Ледфорда и Смайлса (1952). Однако при применении фазово-контрастного микроскопа не было обнаружено никаких качественных различий между нормальными и опухолевыми клетками.
Наши знания относительно структуры митохондрий и других компонентов клетки значительно расширились в результате применения метода электронной микроскопии (Селби, 1953). При «малом» увеличении (в 10 000 раз) митохондрии выглядят так же, как в обычном микроскопе, когда исследуются уплощенные участки клеток. На фиг., которая приведена ниже и демонстрирует так называемые «гранулы роста», митохондрии имеют вид темно-серых удлиненных телец червеобразной формы; их внутреннее строение почти неразличимо. Однако на сделанных при больших увеличениях микрофотографиях очень тонких срезов клеток можно ясно видеть характерные особенности внутренней архитектуры митохондрии. Великолепные электронные микрофотографии продольных и поперечных срезов митохондрий сделаны Палэйдом (1953).
Этот автор указывает, что тип организации митохондрий не зависит от вида животного или от типа клеток. До мнению Палэйда, каждая митохондрия имеет следующие составные элементы:
1. Пограничная мембрана.
2. Митохондриальная матрица, которая в пределах разрешающей способности современных электронных микроскопов представляется бесструктурной.
3. Система внутренних перегородок, отходящих от внутренней поверхности мембраны; во многих митохондриях эти перегородки перпендикулярны их длинной оси и располагаются рядами, параллельно друг другу, через более или менее одинаковые интервалы.
На удачных электронных микрофотографиях митохоидриальная мембрана, по-видимому, двуслойна, а перегородки представляют собой складки, образуемые второй, внутренней митохондриальной мембраной. Исследования Палэйда дополняют, а не опровергают результаты исследований Глимстедта и Лагорстедта (1953), Сьестранда (1953) и Спиро (1953). Предстоят выяснить, насколько точно детали, которые видны на микрофотографиях Палэйда, сделанных при увеличениях 18 600—66 900, соответствуют истинной структуре митохондрий в живых клетках. При электронно-микроскопическом исследовании приходится фиксировать ткань (обычно в смесях, содержащих осмиевую кислоту), заливать ее, приготовлять срезы и подвергать их действию высоких температур, создаваемых электронной бомбардировкой. При этом, вероятно, происходит уменьшение объема митохондрий примерно на 25%.
Однако при применении обычного микроскопа для изучения митохондрий до и после изготовления электронных микрофотографий не удастся обнаружить существенных изменений их объема. Под влиянием такой обработки в митохондриях неизбежно должны возникать новые структуры, отсутствующие in vivo. Возможно, что попытки подготовки тканей для электронной микроскопии путем применения модифицированного метода молекулярной сушки (замораживания-высушивания) в будущем окажутся успешными (Уильямс, 1953).
Так как живые митохондрии никогда нельзя будет исследовать при помощи электронной микроскопии, то всегда будет трудно оценить значение данных, полученных при использовании этого метода. Удивительное явление представляют собой изменения (по-видимому, спонтанные) формы митохондрий в живых клетках, которые столь демонстративно можно видеть в кинофильмах. Митохондрии искривляются, образуют петли и вновь выпрямляются. Нередко они распадаются на небольшие палочки или шарики, причем шарики в некоторых случаях удлиняются или набухают. Возникает вопрос, что происходит в таких условиях с внутренней структурой митохондрий. Как видно на фигуре, все промежутки между перегородками почти равны между собой. Еще меньше варьирует толщина перегородок и вещества, располагающегося между пластинками. Изменяются ли эти структуры, когда происходит описанные изменения формы и величины отдельных митохондрий? Изменяются ли одновременно химические и физические свойства отдельных частей этих митохондрий или же по мере изменения формы митохондрии ее внутренняя архитектура постепенно приспосабливается к этой форме, так что общий тип внутренней организации сохраняется?
Весьма поучительны электронные микрофотографии клеток опухоли печени, любезно присланные мне доктором Л. Хэмом; подробное описание приводится в подписях. Когда эти исследования А. Хэма будут опубликованы, в них, вероятно, будут детально изложены различия между злокачественными и нормальными клетками. До тех пор пока не будут изучены патологические контроли, т. е. патологические, но незлокачественные клетки, мы не сможем решить вопрос о том, являются ли изменения митохондрий, обнаруживаемые при электронной микроскопии, фундаментальным признаком, отличающим раковые клетки от их нормальных прототипов.
Следует без предубеждения отнестись к вопросу о вирусах как возможных этиологических агентах, вызывающих раковую опухоль у человека.
При электронной микроскопии многие вирусы обнаруживаются в виде частиц, нередко имеющих очень характерную форму и величину. Поэтому отсутствие подобных частиц в превосходных препаратах митохондрий, представленных выше, может иметь некоторое значение.
В настоящее время можно сделать только тот вывод, что в некоторых очень точных химических исследованиях при сравнении различных типов клеток, которые подвергались злокачественному превращению, были выявлены некоторые количественные химические различия между митохондриями нормальных и злокачественных клеток.
Мы не можем, конечно, предвидеть, какие результаты даст направленное изучение митохондрий, которое сейчас многими проводится. Мы проверяем одно за другим различные морфологические и химические свойства микроскопически видимых компонентов клетки, и приходится констатировать, что результаты этих исследований повторяются с большой монотонностью, так как ни в одном случае не удается обнаружить изменений, лежащих в основе злокачественности.
ПРИЧИНЫ И СИМПТОМЫ
