За последнее время большое внимание уделяется вопросам лекарственной терапии опухолей. Эмпирически или используя имеющиеся сведения об особенностях опухолевого роста и состоянии организма при опухолевой болезни, многочисленные исследователи предпринимают попытки экспериментальной терапии опухолей с помощью разнообразных химических соединений, продуктов жизнедеятельности различных микроорганизмов (антибиотики), гормонов и т. п.
Все чаще появляются сообщения об успешном лекарственном воздействии на опухоли. Однако в настоящее время мы зачастую не можем достаточно правильно оценить лечебные возможности того или иного вновь предлагаемого средства. Объясняется это не только неадекватностью применяемых в эксперименте моделей злокачественным опухолям человека, но и тем, что разные исследователи пользуются самой различной методикой постановки опытов и, главное, самыми различными, а иногда и неправильными способами оценки противоопухолевой активности предлагаемых лекарственных препаратов.
Подобное положение не только не способствует, а, наоборот, мешает успешному развитию работ в области лекарственной терапии опухолей. Для того чтобы сравнивать результаты различных воздействий на опухолевую болезнь в эксперименте и выбирать из многочисленных предлагаемых средств наиболее перспективные в смысле их клинического применения, требуется анализ и определенная унификация методики экспериментальной терапии опухолей и особенно методов оценки эффективности противоопухолевых препаратов.
В настоящем сообщении мы остановимся на некоторых методах отбора, изучения и сравнения химиотерапевтических противоопухолевых агентов. Под химиотерапией опухолей мы понимаем применение с лечебной целью таких соединений, которые бы губительно воздействовали на опухолевую ткань, не оказывая столь же вредного влияния на нормальные ткани, органы и системы организма. Такое определение предполагает прямой механизм действия химиотерапевтических агентов на клетку, и все существующие методы отбора противоопухолевых веществ исходят из этого представления. Из сказанного становится ясным, что для попыток подавить рост опухоли путем воздействия на организм излагаемые ниже методы исследования пригодны лишь отчасти.
Известно большое количество методов отбора противоопухолевых веществ. Часть из них разработана довольно хорошо и имеет множество модификаций, а некоторые только разрабатываются, хотя и имеют большие перспективы. Все эти методы можно классифицировать следующим образом:
I. Отбор по действию на неопухолевые объекты.
а) Действие на микроорганизмы.
б) Действие на разного рода пролифераты.
II. Отбор по действию на опухоли.
1. Действие in vitro.
а) Действие на переживающие опухолевые клетки.
б) Действие на растущие культуры опухолевых тканей.
2. Действие на опухолевые клетки, растущие в организме, при непосредственном их контакте с исследуемым веществом.
а) Действие на плотные (солидные) перевиваемые опухоли животных при внутриопухолевом введении вещества.
б) Действие на асцитные формы перевиваемых опухолей животных при внутрибрюшинном введении.
в) Действие на трансплантаты животных и человека, растущие на хорионаллантоисе куриного зародыша.
3. Действие на гомо- и гетеротрансплантаты опухолей.
а) Действие на перевиваемые опухоли животных: плотные (солидные) и асцитные формы, лейкозы.
б) Действие на гетеротрансплантаты опухолей человека, растущие у мелких лабораторных животных (крысы, мыши, хомяки).
4. Действие на спонтанные и индуцированные опухоли животных.
Не только детальное описание этих методов исследования, но даже простой разбор всех их преимуществ и недостатков заняли бы слишком много места, поэтому в настоящем сообщении мы не можем на них останавливаться. Отчасти этот пробел компенсируется другими авторами монографии; подробные же сведения о некоторых методах применительно к химиотерапии опухолей можно получить из работ, приведенных в указателе литературы. Мы хотели бы отметить лишь следующее: если адекватность перечисленных выше моделей злокачественным опухолям человека возрастает (при принятом порядке расположения), то одновременно возрастают материальные затраты и трудности в измерении эффекта. В связи с этим нужно сказать несколько слов о тех требованиях, которые предъявляются к методам отбора противоопухолевых веществ.
Основные два требования к методам отбора: надежность и быстрота. Однако эти два требования трудно совместимы, и обычно приходится частично поступаться каким-либо из них. Так, при отборе противоопухолевых антибиотиков и отчасти веществ растительного происхождения настолько необходима быстрота исследования, что оно, как правило, ведется методами in vitro, т. е. в известный ущерб точности ответа. При исследовании синтетических препаратов, а также химически индивидуальных веществ растительного или бактериального происхождения мы уже можем в качестве первого требования к методике выдвинуть ее точность и надежность, а затем уже быстроту.
С точки зрения надежности и точности получаемых ответов в настоящее время наиболее пригоден метод отбора и изучения противоопухолевых веществ в опытах на животных с перевиваемыми опухолями. Однако этот метод может дать удовлетворительные результаты, если исследователь все время будет помнить о двух его недостатках, а именно: 1) неадекватность ответа на химиотерапевтическое вмешательство перевиваемых опухолей животных и опухолей человека одинакового гистогенеза и сходного или даже одинакового гистологического строения; 2) вариабильность роста перевиваемых опухолей у отдельных животных и зависимость его от ряда подчас трудно учитываемых деталей эксперимента.
Первую трудность (или недостаток) можно проиллюстрировать следующими примерами, d, l, n-ди (2-хлорэтил) аминофенилаланин наиболее сильно действовал на веретеноклеточную саркому 45 крыс и потому был назван сарколизином. Однако у человека он оказался наиболее активным по отношению к семиномам яичка и не обладал лечебным действием при типичных саркомах. Противоопухолевая активность милерана (1,4-диметансульфоноксибутан, миелосан) была обнаружена в опытах на крысах с карциномой Уокера, а в клинике это соединение оказалось активным только при хронической миелоидной лейкемии. Антагонисты фолиевой кислоты, 6-меркаптопурин, азосерин, ДОН, в эксперименте подавляют рост мышиной саркомы Крокера (саркома 180), а в клинике эффективны только при острых и отчасти хронических лейкозах. Таким образом, в реакции на химиотерапевтические агенты опухолей человека и перевиваемых опухолей животных нет параллелизма (возможно, он будет обнаружен при выяснении всех деталей обмена веществ опухолей). Однако этот факт не должен обескураживать исследователей, так как опыт химиотерапии опухолей показывает, что в клинике активными оказываются те соединения, которые действуют хотя бы на одну какую-либо опухоль в эксперименте. В то же время напрашивается вывод, что достаточно полноценный отбор, без риска пропустить активный препарат, может вестись лишь на нескольких опухолях, а не на какой-либо одной из них.
На результатах эксперимента может сказаться еще одна особенность такой модели злокачественного роста, как перевиваемые опухоли животных. Мы перевиваем животному хотя и гомологичную, но все же чужеродную ткань, и в ответ на это в организме возникают иммунологические реакции, обусловленные тканевой несовместимостью и другими факторами. У устоявшихся штаммов перевиваемых опухолей злокачественность, или «вирулентность», так высока, что она преодолевает все иммунологические барьеры и обеспечивает рост опухолей почти у всех животных. Однако при повреждении опухоли химиотерапевтическим агентом положение меняется и иммунологические факторы могут сыграть роль.
Вторая трудность работы с перевиваемыми опухолями животных — вариабильность их роста и зависимость результата опыта от целого ряда условий — является трудностью чисто методической, и на ее преодолении мы остановимся ниже. Несмотря на только что сделанные замечания, метод отбора и изучения противоопухолевых препаратов в опытах на животных с перевиваемыми опухолями является достаточно надежным. Мы изложим его детали в том варианте, который нам кажется достаточно удовлетворительным. Метод представляет собой длинную цепь последовательных определений (проб) и подразделяется на ряд этапов. Мы попытаемся осветить следующие вопросы:
I. Определение токсичности.
1. Ориентировка в токсичности.
2. Более точное определение токсичности.
3. Патологогистологические и гематологические исследования.
II. Определение противоопухолевой активности.
4. Условия опытов.
5. Критерии оценки опухолевого роста.
а) Плотные (солидные) формы.
б) Асцитные формы.
в) Лейкозы.
6. Спектр противоопухолевого действия.
7. Использование лекарственноустойчивых вариантов опухолей.
8. Некоторые статистические проблемы.
9. Сравнительная количественная оценка противоопухолевого действия.
10. Тактика исследования.
Мы не намерены преподнести готовый рецепт изучения соединений с предполагаемой противоопухолевой активностью, да это и невозможно. Кроме того, предлагаемый метод во всей его полноте целесообразен лишь в том случае, если обнаружена хотя бы небольшая активность у вещества новой группы или класса или есть надежда, что вещество из известной группы противоопухолевых соединений превосходит своих предшественников по избирательности действия на опухоль или отличается от них по противоопухолевому спектру. Для того чтобы пояснить нашу тактику в исследованиях по химиотерапии опухолей, мы в качестве примера приводим схему и описание изучения гипотетических препаратов А, В и С с вымышленными дозами и эффектами.
В конце статьи мы сочли целесообразным дать в виде приложения видоизмененный метод Стьюдента — Фишера для вычисления достоверности разницы между подопытной и контрольной группами.
Определение токсичности
Определение токсичности препаратов с предполагаемым противоопухолевым действием не имеет какой-либо онкологической специфики и осуществляется по принятым в токсикологии методам. Но поскольку без данных о токсичности невозможна не только характеристика противоопухолевого действия вещества, но даже постановка первого опыта по обнаружению этого действия, мы вкратце остановимся на этом вопросе.
Ориентировка в токсичности
На первом этапе определения токсичности основными требованиями являются следующие: как можно быстрее и как можно меньше животных и препарата. Поэтому опыты ставятся на небольшом количестве (3—5 на дозу) мелких лабораторных животных (мыши, крысы). Так как биологическая активность препарата совершенно неизвестна, то целесообразно испытать действие однократного введения вещества в двух, далеко отстоящих друг от друга дозировках. Если вещества мало и приходится испытывать его только в одной дозе, то лучше начинать с большей, так как опыт показывает, что наибольшее количество препарата, животных и времени тратятся при поисках летальных доз от малых к большим, а не наоборот.
Пути введения препарата могут быть различными, но нужно стараться вводить его парентерально, т. е. внутрибрюшинно, внутривенно, в крайнем случае — подкожно. При введении per os препарат может оказаться нетоксичным или малотоксичным не потому, что данная химическая структура биологически не активна, а потому, что вещество может в желудочно-кишечном тракте не всасываться или разрушаться. Иногда для нерастворимых в воде соединений применяются растворители, небезразличные для организма, например этиловый спирт или бензол. Кроме того, препарат может обладать небезразличными для организма физико-химическими свойствами (кислота, щелочь, раствор с большим осмотическим давлением). В этих случаях обязательной является группа технического контроля, т. е. введение группе животных того же объема одного растворителя, среды, на которой готовят препарат и др.
Гибель животных может наступить как в первые минуты и часы после введения вещества, так и в более отдаленные сроки. Поэтому следует наблюдать за животными не менее 30 дней. Однако если животные не погибли в течение 7—10 дней, то, не прекращая наблюдения за ними, можно поставить на небольшом количестве животных второй опыт с более высокими дозами, что может сократить сроки ориентировки в токсичности.
Более точное определение токсичности
После того как мы ориентировались в границах дозировок, от которых животные гибнут при однократном введении препарата, следует уточнить эти данные и определить ДЛ50, т. е. дозу, вызывающую гибель половины животных. Лишь в случае очень малого количества препарата или большого его расхода (из-за малой токсичности) можно поставить первые опыты по определению противоопухолевого действия после ориентировки в токсичности на малом числе животных.
В токсикологии считается, что ДЛ50 является величиной, более правильно отражающей токсичность вещества, чем ДЛ100 или максимально переносимая доза (ДПМ). Объясняется это тем, что индивидуальная чувствительность животных очень вариабильна и при увеличении числа наблюдений обязательно попадутся животные с повышенной чувствительностью, которые не перенесут ранее установленную ДПМ, и животные с пониженной чувствительностью, которые не погибнут от ранее установленной ДЛ100. Таким образом, при увеличении числа наблюдений, т. е. при повторении опытов, ДПМ имеет тенденцию к снижению, а ДЛ100 — к повышению. Такой определенной тенденции для ДЛ50 нет.
Опыты по определению ДЛ50 при однократном введении ставятся так же, как и ориентировочные опыты, но увеличивается число дозировок и число животных в группе. Так, следует испытать действие не менее чем трех доз, вводя вещество в каждой дозе не менее чем 10 животным. В конце опыта, т. е. через 30 дней, можно определить процент гибели животных от каждой дозы препарата и построить кривую нарастания токсичности по мере увеличения дозы. Если кривую токсичности построить на полулогарифмической или пробитной сетке, то ДЛ50 можно вычислить путем интерполяции (интерполяцией называется нахождение промежуточного числа по двум, рядом стоящим числам). Для постановки первых опытов по определению противоопухолевого действия достаточно определить ДЛ50 один раз, но если обнаружится, что вещество обладает противоопухолевой активностью и возможно его клиническое применение, то опыты по определению токсичности повторяют еще 1—2 раза и устанавливают ДЛ50 для разных видов животных.
Однократное введение вещества с лечебной целью применяется крайне редко, а потому большой интерес представляют данные токсичности при многократных введениях. Определить ДЛ50 при многократных введениях не так уж трудно, но при постановке такого опыта сразу возникает целый ряд вопросов. Действительно, если при однократном введении процент гибели животных зависит только от одного фактора — величины дозы, то при многократных введениях результаты опыта определяются рядом факторов, прежде всего числом введений и интервалами между ними. Так, ДЛ50 будет одна для 5 введений, другая — для 10, третья — для 15 и т. д. Она будет разной и при одинаковом числе инъекций, если, например, интервал между введениями увеличить с 24 часов до 48 или 72 часов. Отсюда следует, что если за критерий токсичности взять ДЛ50 при многократных введениях, то прежде всего нужно договориться о числе и частоте введений.
Однако в исследованиях по химиотерапии опухолей следует учитывать еще одно обстоятельство: животные с опухолями иначе реагируют на введение препарата, чем здоровые. Чаще всего это выражается в большей чувствительности животных с опухолями. Но в ряде случаев при выраженном противоопухолевом действии препарата наблюдается другая картина: животные с опухолями переносят значительно большие дозы препарата, чем здоровые животные, причем тем большие дозы, чем больше опухоль. Однако тот же препарат может оказаться более токсичным, если животным того же вида привить другую, менее чувствительную опухоль, т. е. чувствительность к ядам животных, которым привиты разные опухоли, различна.
Таким образом, для препаратов с предполагаемым противоопухолевым действием токсичность при многократных введениях следовало бы определять не только на здоровых животных, но и на животных с разными опухолями, но всегда при одинаковом числе и частоте введений. Такие опыты, по сути дела не будут отличаться от опытов по определению противоопухолевой активности. Кроме того, выдержать условие одинакового числа инъекций в опытах с разными штаммами опухолей нельзя, так как длительность опыта определяется не столько желанием экспериментатора, сколько скоростью роста опухоли. Все сказанное заставляет нас считать, что после определения ДЛ50 при однократном введении йрепарата целесообразно перейти к испытанию его противоопухолевой активности. Если же такая активность будет обнаружена, то в ходе терапевтических опытов с разными дозами станет ясной и токсичность препарата при многократных введениях.
Патологогистологические и гематологические исследования
Возможность практического использования различных средств, обладающих противоопухолевым действием, предопределяется не только этим их свойством, а в значительной степени зависит от влияния препаратов на организм в целом. Поэтому изучение биологического действия отобранных противоопухолевых препаратов включает, помимо более точного определения токсичности, еще ряд исследований, в частности патологогистологическое изучение внутренних органов животных, получавших препарат в различных дозировках, проведение ряда фармакологических проб и т. д. Разумеется, что клиническое применение какого-либо средства поставит еще ряд других вопросов, но мы на них не останавливаемся, поскольку это уже не относится к собственно поискам новых противоопухолевых средств.
Если противоопухолевая активность соединения установлена, то прежде всего следует изучить наличие морфологических изменений во внутренних органах животных после введения препарата в летальных и токсических дозировках. Для этого ставится опыт с однократным введением препарата в уже установленной ДЛ50 и дозах, близких к ДЛ100 и ДПМ. Животных при введении ДЛ100 и ДЛ50 убивают незадолго до их гибели, срок которой уже ранее установлен, животных, которым была введена ДПМ, — в это же время. Наличие морфологических изменений при введении препарата в летальных и токсических дозировках ни в коем случае не говорит о невозможности его практического использования, но эти опыты позволяют установить наиболее поражаемые системы организма, а также ориентироваться в том, что следует ожидать при передозировках препарата.
Наибольшее значение имеет патоморфологическое исследование внутренних органов животных, длительное время получавших препарат в «терапевтических» дозах. Не обязательно ставить эти опыты на здоровых интактных животных. Можно исследовать и получавших препарат подопытных животных с опухолями. Однако в последнем случае всегда следует учитывать влияние опухоли на организм. Поэтому необходимо сопоставлять данные, полученные в таких опытах, с результатами изучения внутренних органов животных контрольной группы. Следует помнить также о спонтанной патологии животных, которая, к сожалению, изучена еще далеко не полно.
Многие из известных в настоящее время соединений с противоопухолевой активностью обладают угнетающим действием на систему крови. Таковы галоидоалкиламины, этиленимины, этиленфосфор- и этилентиофосфорамиды, уретаны, амино- и тиопроизводные пурина, антагонисты фолиевой кислоты, колхицин и близкие к нему соединения и др. Поэтому при изучении вещества с противоопухолевой активностью всегда следует ориентироваться в его действии на гемопоэз, а если препарат предполагают передать на клинические испытания, то становится обязательным детальное гематологическое исследование.
Угнетение гемопоэза можно обнаружить при патологогистологическом исследовании органов кроветворения. Однако это свойство препарата можно заметить и раньше, в первых опытах по определению токсичности и противоопухолевого действия. Так, достаточно высокие дозы препарата могут вызвать аплазию лимфоидных органов (селезенка, лимфатические узлы, вилочковая железа), что будет сопровождаться уменьшением их размеров, и веса. Поэтому уменьшение веса селезенки у подопытных животных может служить первым сигналом о действии на кроветворение. Разумеется, что такое заключение является сугубо предварительным, так как, во-первых, в селезенке даже у мелких животных в основном происходит образование лимфоцитов, а во-вторых, вес этого органа зависит не только от количества лимфоидных элементов, но и от степени его наполнения кровью, а также других факторов (вес селезенки павших животных учитывать не следует).
Вторым мероприятием, позволяющим определить действие препарата на кровотворение без постановки специальных опытов, является взятие крови у подопытных и контрольных животных до и в течение терапевтического опыта. Подсчет общего количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы может дать ценные сведения о влиянии препарата на кровотворение. В такого рода исследованиях следует учитывать лишь следующее: прививка и рост опухоли часто сопровождаются гиперплазией кроветворных органов и лейкоцитозом, а в некоторых случаях опухоль, например саркома Крокера (180), вызывает даже лейкемоидную реакцию.
Детальное гематологическое исследование удобнее проводить на более крупных животных, например на кроликах, кошках, собаках. У этих животных картина периферической крови более постоянна, а кроме того, у них возможна пункция костного мозга и изучение миелограмм. Техника таких исследований хорошо известна и освещена в руководствах по гематологии. Здесь же следует указать, что ответ должен быть получен прежде всего на два вопроса: 1) наблюдается ли угнетение гемопоэза от доз, вызывающих угнетение роста опухоли; 2) если наблюдается угнетение гемопоэза, то обратимо ли оно и как скоро наступает регенерация.
Определение противоопухолевой активности
Условия опытов по определению противоопухолевой активности
В этом разделе речь идет о самых обыденных вещах, о повседневных «мелочах» экспериментальной работы: о количестве животных в опыте, о разбивке их на группы, о контроле, дозировках и т. п. Пренебрежение этими «мелочами», несоблюдение элементарных правил эксперимента сплошь и рядом приводит к малообоснованным, слишком оптимистическим выводам и к горьким разочарованиям.
Количество животных в опыте, достаточное для того, чтобы сделать правильное заключение о противоопухолевой активности вещества, определяется двумя факторами: вариабильностью роста выбранной опухоли и силой противоопухолевого действия препарата, которая в первом опыте, разумеется, еще не известна. Ниже мы остановимся на некоторых статистических проблемах, возникающих при постановке опытов по экспериментальной химиотерапии опухолей. Здесь же мы попытаемся дать рекомендации о количестве животных, исходя из многолетнего опыта товарищей по работе и своего личного.
Опыт работы показывает, что в опытах с перевиваемыми опухолями число животных должно быть не менее 10 в группе, а при малой активности препарата или при больших отклонениях выбранного штамма в прививаемости, размерах и весе опухолей у отдельных животных — не менее 20 в группе. Только в первом опыте, цель которого не столько определение противоопухолевой активности, сколько ориентировка в дозах, переносимых животными при многократных введениях, допустимо взять в каждую группу по 5 животных.
Если опыт поставлен таким образом, что имеется лишь одна подопытная группа, то число животных в контрольной и подопытной группах может быть одинаковым. Если же контрольная группа является общей для нескольких подопытных групп, то число животных в ней нужно увеличить в 1 1/2—2 раза. Контрольная группа в большинстве случаев включает животных, с которыми не проводят каких-либо манипуляций. В дополнение, в оговоренных выше случаях, необходимо осуществлять так называемый технический контроль (с количеством животных, не меньшим, чем в подопытной группе).
Разбивка животных на группы оказывает большое влияние на результат опыта и должна быть правильной. При большом числе животных и достаточной однородности объекта исследования можно было бы использовать для разбивки схему случайно взятых (рендомизированных) групп. Однако в опытах по экспериментальной химиотерапии оба эти условия трудно выполнимы, и поэтому лучше разбивать животных на группы по определенным признакам.
Прежде всего еще до перевивки подбирают однородных по весу животных. Некоторое влияние на степень роста перевиваемых опухолей имеют возрастные и половые различия. Поэтому пол и возраст животных также нужно учитывать. Так как часто бывает трудно подобрать для большого опыта животных одного пола, то во всяком случае самцы и самки должны быть распределены по группам равномерно.
Опыты на животных с асцитными формами опухолей или лейкозами начинаются вскоре после перевивки, а потому животных разбивают на группы без учета прививаемости и интенсивности роста опухоли. При постановке опытов на животных с солидными формами опухолей непосредственно перед началом лечения животных разбивают на группы по размерам опухолей. Желательно, чтобы средняя величина опухолей в подопытной и контрольной группах была одинаковой. Особенно нельзя допускать, чтобы средняя величина опухолей в подопытной группе была меньше, чем в контрольной.
Более трудной является разбивка животных на контрольную и подопытную группы в опытах со спонтанными и индуцированными опухолями, так как в этом случае опухоли у отдельных животных сильно разнятся по величине и по срокам возникновения. Поэтому в такие опыты животных лучше всего подбирать попарно или по троицам (в случае технического контроля), т. е. в контрольную и подопытную группы отсаживать по одному из двух иди трех животных с опухолями одинакового размера. Каждая спонтанная или индуцированная опухоль может отличаться от других по скорости роста и даже по гистогенезу, но эти обстоятельства трудно учесть до опыта.
Сроки начала и окончания опыта определяются особенностями выбранного для исследования штамма. Следует учитывать, что результаты лечения в значительной степени зависят от того срока, который прошел от момента перевивки опухоли до начала введений препарата. При этом результаты тем лучше, чем раньше начато лечение. Однако вряд ли следует пытаться улучшить результаты опыта, начиная лечение как можно раньше, так как это снижает их достоверность. При работе с солидными формами опухолей мы испытываем действие веществ на уже привившиеся и растущие опухоли, чтобы в какой-то мере говорить о лечении, а не о профилактике приживляемости. Это условие будет выполнено, если мы, например, начнем введение препарата крысам с саркомой 45 на 7-й день после перевивки, а с саркомой Иенсена — на 4—5-й день, с карциномой Уокера — на 3—4-й день и т. д. В опытах на мышах мы обычно начинаем введение препарата на 4-й день после подкожной перевивки опухоли Эрлиха и на 5—6-й день после перевивки саркомы Крокера (180).
В опытах с асцитными формами опухолей и лейкозами, когда трудно контролировать прививаемость в первые дни после прививки, а длительность жизни привитых животных невелика, лечение, как правило, начинают через сутки после прививки. В большинстве случаев незадолго до гибели животных наблюдается изъязвление опухоли, что ведет к изменению ее веса и может исказить результаты опыта. Поэтому (если в качестве критерия активности не использовать длительность жизни) начинающееся изъязвление опухолей и гибель отдельных животных в контрольной группе служат сигналом к окончанию опыта. Поскольку вторым фактором, определяющим длительность опыта, является число введений препарата, то на конкретных сроках окончания опыта мы остановимся ниже.
Пути введения препарата могут быть различными, но, как мы уже говорили, в первых опытах лучше вводить вещество парентерально, т. е. внутривенно, внутрибрюшинно или подкожно. Следует помнить, что при асцитных формах опухолей внутрибрюшинное введение приводит к непосредственному контакту вещества с опухолевыми клетками, а потому результаты таких опытов не говорят об избирательности действия препарата. Для доказательства избирательности действия в опытах с асцитными формами вещество следует вводить внутривенно, подкожно или per os.
Дозы, интервалы и длительность курса введений имеют решающее значение в опытах по химиотерапии опухолей. В то же время эти условия опыта могут быть различны на разных этапах исследования.
На первом этапе очень важным моментом является выбор разовой дозы для первого опыта, так как имеется опасность двоякого рода: при слишком большой дозе можно принять за противоопухолевую активность неспецифическое общетоксическое действие препарата, а при слишком малой дозе — упустить препарат с несомненной активностью. Мы считаем, что лучше пойти на риск получить в первом опыте некоторую долю активности за счет общетоксического действия, чем ошибочно отбросить препарат, в действительности обладающий активностью; поэтому мы стараемся взять разовую дозу, близкую к максимальной переносимой при многократных введениях.
Так как с веществом, противоопухолевая активность которого еще не установлена, мы не ставим специальных опытов по определению токсичности при многократных введениях, то при выборе дозы для первого опыта на животных с опухолью приходится ориентироваться на данные по токсичности при однократном введении. Опыт работы с противоопухолевыми веществами из различных групп и классов химических соединений показал, что животные переносят многократные (12—20 раз) введения разовой дозы, которая примерно равна 1/10—1/4 ДЛ50 при однократном введении. Исходя из этого, мы рекомендуем в первом опыте испытать вещество в разовой дозе, равной примерно 1/6 ДЛ50 при однократном введении. При таком подходе к выбору дозы мы можем столкнуться с двумя неприятностями, а именно: или все животные погибнут задолго до намеченного срока окончания опыта или все животные легко перенесут выбранную дозу, но рост опухолей в подопытной группе не будет отставать от роста в контрольной. В том и в другом случае целесообразно вновь поставить опыт на небольшом числе животных, но уже с несколько меньшей или большей дозой.
После одного или нескольких первых опытов на небольшом числе животных станет ясной максимальная доза, переносимая при многократных введениях (ДПМ); дальнейшие опыты можно было бы продолжать с этой дозой вещества, однако перевиваемые опухоли как модель патологического процесса имеют одну особенность, которая не позволяет при определении противоопухолевой активности ориентироваться только на действие ДПМ. В специальных опытах на крысах с карциномой Уокера установлено, что частичное голодание животных может вызвать торможение роста опухоли до 40—60% по сравнению с животными, получавшими пищу в достаточном количестве. Между тем ДПМ, не вызывая гибели животного, может оказывать токсическое действие на организм и вести к значительному похуданию животного. Потеря в весе объясняется не только специфическим действием препарата на обмен веществ или функцию желудочно-кишечного тракта, но также и тем, что животное начинает меньше есть. Нарушение же питания может сказаться не только на росте животного, но и на росте опухоли. Все это заставляет нас говорить о так называемой максимальной «терапевтической» дозе (ДТМ).
Под ДТМ мы понимаем максимальную разовую дозу, которую можно давать животным длительное время (12 дней мышам и 20 дней крысам), не вызывая их гибели и похудания более чем на 10% от исходного веса. Уже из определения видно, что ДТМ характеризует не терапевтические, а токсические свойства препарата и по величине является дозой, лишь несколько меньшей ДПМ.
Для некоторых соединений и групп соединений большое значение имеет ритмика их введения в организм, т. е. длительность интервала между отдельными введениями. Например, нами было показано, что результаты экспериментального лечения саркомы 45 некоторыми хлорэтиламинами и этилениминами значительно лучше, если эти препараты вводить не один раз в сутки, а более редко — один раз в 72 часа. Для других препаратов решающим фактором может быть постоянство их концентрации в крови и тканевых жидкостях, что заставляет вводить препарат чаще чем один раз в сутки. Однако в поисковой работе все эти обстоятельства еще не известны. Поэтому, если нет каких-либо теоретических, априорных соображений относительно частоты введения, опыты лучше всего начинать с введения препарата один раз в сутки, не делая перерывов в воскресные дни хотя бы в первой половине опыта.
Число введений препарата при интервалах между ними в 24 часа определяется сроками начала и окончания опыта. Поскольку эти сроки определяются особенностями роста штамма, то в опытах на разных штаммах трудно соблюсти условия одинакового числа инъекций. Однако в опытах на животных с солидными формами опухолей мы стараемся сделать не менее 12 введений мышам и не менее 15—20 введений крысам. В опытах с асцитными формами опухолей и лейкозами число инъекций часто приходится снижать до 8 из-за того, что на 8—9-й день после перевивки уже начинается гибель животных в контрольной группе.
Можно, разумеется, сделать и меньшее число введений, однако мы хотели бы предостеречь от этого. Дело в том, что биологический эффект от введения препарата, как токсический, так и противоопухолевый, может проявиться не сразу, а с задержкой на несколько суток. В таком случае, например после 12 инъекций, мы наблюдаем эффект 7—8 введений и можем заметить как токсическое, так и противоопухолевое действие. Если же ограничиться 10, 7 или, как предлагает Друкрей, даже 4 введениями, то можно получить совершенно неправильное представление о биологической активности препарата. Мы часто сталкивались с фактом, что указанные в литературе дозы, вводимые 7 или 10 дней подряд и считавшиеся «терапевтическими», не только при введении свыше 10 раз, но просто при наблюдении животных, получивших 10 инъекций, свыше 12 дней, оказываются летальными.
Критерии оценки опухолевого роста
Препарат, обладающий противоопухолевым действием, может вызвать замедление скорости роста опухоли, полную задержку роста и, наконец, рассасывание уже имеющейся к началу лечения опухоли. Торможение роста опухоли может сопровождаться или не сопровождаться удлинением жизни подопытных животных. Гистологическое исследование может показать, что препарат вызывает определенные морфологические изменения в опухолевой ткани (некроз, лизис части опухолевых клеток, пикноз ядер, уменьшение числа митозов, разрастание соединительной ткани и т. д.).
Правильная оценка противоопухолевой активности требует правильного количественного определения всех этих показателей роста опухоли и действия на нее химиотерапевтического агента. Однако такой подход не всегда осуществим, так как между различными показателями опухолевого роста нет параллелизма и все они чрезвычайно вариабильны. В этом разделе мы остановимся на описании и раэборе наиболее простых и достаточно надежных критериев оценки опухолевого роста, начав это с показателя, имеющего к опухоли косвенное отношение, а именно с веса животных.
Изменение веса животных, подвергавшихся воздействию какого-либо препарата, имеет немаловажное, а иногда и решающее значение в оценке противоопухолевой активности этого препарата. Опыты по экспериментальной терапии опухолей обычно ставят хотя и на половозрелых, но молодых животных. Такие животные за определенный период должны прибавлять в весе. Эта прибавка в весе объясняется не только ростом животного, но и ростом опухоли. В то же время бурно растущая опухоль тормозит рост животных в контрольной группе, и в конце опыта они могут весить (за вычетом веса опухоли) лишь немногим больше, чем до опыта, а иногда наблюдается и снижение веса.
Как правило, мы взвешиваем животных в день начала введений и в конце опыта, затем вычисляем вес животных в конце опыта за вычетом опухоли и определяем, насколько
велика прибыль или потеря в весе по сравнению с исходными данными. Контрольную и подопытные группы между собой мы сравниваем уже по этому показателю — прибавке или убыли в весе, средней для группы; этот показатель можно выразить в процентах от исходного веса. Изменение веса животных с асцитными формами опухолей будет разобрано ниже.
Если не говорить о цитологических тестах повреждения опухоли (митотический индекс, число живых и мертвых клеток и т. д.), пробах на прививаемость, а также длительности жизни животных, то выбор других показателей роста не может быть одинаковым для разных форм перевиваемых опухолей: плотных (солидных), асцитных и лейкозов. Поэтому мы разберем эти показатели раздельно, по формам перевиваемых опухолей.
а) Плотные (солидные) формы
Измерение опухолей, растущих под кожей, может дать линейные и объемные величины. В том и в другом случае для этого перед началом введений препарата каждые 3 или 5 дней в течение курса лечения и в момент окончания опыта опухоли измеряют по трем направлениям: длине, ширине и высоте. Для каждой опухоли можно затем вычислить средний диаметр (линейная величина). Упрощенно средний диаметр можно определить как среднее арифметическое длины, ширины и высоты.
Для каждой группы, подопытной и контрольной, на каждое измерение вычисляется среднее арифметическое из средних диаметров отдельных опухолей. Полученные данные могут быть изображены графически: на оси абсцис откладываются дни после перевивки, а на оси ординат — средние диаметры опухолей. О противоопухолевом действии препарата судят по более низкому положению кривой роста опухолей в подопытной группе по сравнению с контрольной.
Некоторые авторы, преимущественно американские, представив средний диаметр (D) опухолей подопытной группы как долю от среднего диаметра опухолей контрольной группы, оценивают степень угнетения роста опухоли по следующей шкале: при среднем диаметре опухоли в подопытной группе до 0,25 среднего диаметра опухоли в контрольной
группе — выраженное угнетение (++); от 0,26 до 0,50 — умеренное угнетение (+); от 0,51 до 0,75 — слабое угнетение (±); от 0,76 и более — отсутствие эффекта (—).
В последнее время в нашей лаборатории Пань Ци-цао и Е. М. Шамаевой было показано, что вычисление среднего объема (объемная величина) дает результаты, более близкие к получаемым при сравнении веса опухолей. Следует указать, что опухоли не представляют собой строго сферического тела, а потому одно лишь измерение опухолей дает не совсем точное представление о действительной разнице в скорости роста опухолей в подопытной и контрольной группах. Однако этот метод следует использовать, так как он позволяет судить об эффективности препарата не только по конечным результатам, но и по изменению размеров опухолей в динамике.
Взвешивание опухолей дает более точное представление о противоопухолевой активности препарата, но оно возможно только в конце опыта. Для этого животных убивают, опухоли вылущивают, взвешивают и вычисляют средний вес опухоли в каждой группе. Затем вычисляют процент торможения роста опухоли данным препаратом в данной дозе по формуле. Предполагаемая формула не является единственной для определения противоопухолевой активности препаратов по весу опухолей. Некоторые авторы применяют так называемый коэффициент активности роста опухоли в подопытной и контрольной группах. Уолпул для определения торможения роста опухоли по весу пользуется очень близкой к приведенной выше формулой, но средний вес опухоли в каждой группе вычисляет только для той половины наблюдений, в которую входят наибольшие по весу опухоли. Однако мы считаем более правильным вычислять процент торможения роста опухоли, не делая произвольной выборки из всей суммы наблюдений, а определяя достоверность результатов методом вариационной статистики.
Некоторые способы определения противоопухолевого действия препаратов являются, по нашему мнению, малоприемлемыми. К числу таких способов относится вычисление так называемого ингибиторного индекса, т. е. отношения среднего веса опухолей в контроле к среднему весу опухолей в подопытной группе (Mк/Mо). При торможении роста опухоли на 50% этот индекс равен 2, т. е. также показывает, что опухоли в подопытной группе вдвое меньше по весу, чем в контрольной. Однако с увеличением тормозящего роста опухоли действия препарата ингибиторный индекс все более и более начинает искажать истинное положение вещей, что наглядно показывает следующий пример.
Допустим, что один из препаратов вызвал резкое угнетение роста какой-либо опухоли и средний вес опухолей в подопытной группе (Мо) равен 1 г, а в контроле (Мк) — 10 г. Другой .препарат также вызывает угнетение роста опухоли, и в этом случае Мo=0,5 г, а Мк=10 г. Если сравнить противоопухолевую активность этих двух препаратов по проценту торможения, то окажется, что они примерно одинаково активны (90 и 95% торможения) . Но если определить ингибиторный индекс, то в первом случае он будет равен 10 : 1 = 10, а во втором случае — 10:0,5 = 20, т. е. может сложиться несоответствующее действительности впечатление, что второй препарат в 2 раза активнее, чем первый. Гораздо лучше применяемое некоторыми авторами отношение Mа/Mк (в приведенном нами примере оно будет равно 0,1 для первого препарата и 0,05 для второго); оно показывает, какую долю веса опухоли в контроле составляет вес опухолей подопытной группы, и является по сути дела величиной, обратной проценту торможения.
б) Асцитные формы
Широко распространено мнение, что асцитные формы перевиваемых опухолей являются более простой моделью злокачественного роста, чем, например, опухоли, растущие под кожей, и что, используя асцитные формы при отборе химиотерапевтических агентов, можно добиться не только большей однородности роста, но и воздействия препарата почти на чистую культуру опухолевых клеток. Между тем все эти представления не выдерживают экспериментальной проверки. Выбор достаточно надежных критериев роста асцитных форм опухолей должен основываться на знании биологических особенностей этой модели.
Не всякую опухоль, которая при внутрибрюшинной прививке может вызвать накопление жидкости в брюшной полости, следует считать асцитной формой. Для асцитных форм обязательны по крайней мере два признака: размножение опухолевых клеток в асцитической жидкости и способность перевиваться асцитической жидкостью. После введения животному в брюшную полость определенного объема асцитической жидкости со взвешенными в ней опухолевыми клетками начинается прежде всего размножение опухолевых клеток и их имплантация на брюшине. Это вызывает эксудацию в брюшную полость, степень которой зависит как от величины обсеменения брюшины, так и от инвазии опухолевых клеток через серозную оболочку. В образовавшейся асцитической жидкости продолжается размножение опухолевых клеток, т. е. их общее число все время увеличивается. Однако оно увеличивается не только за счет размножения клеток в асцитической жидкости, но и за счет попадания их (слущивания) в нее из опухолевых узлов, развившихся на брюшине.
В то же время часть опухолевых клеток подвергается определенной дифференцировке или деградации. Это, а также слущивание мезотелиальных элементов и проникновение лейкоцитов обусловливают очень неоднородный клеточный состав асцитической жидкости. Наконец, под влиянием многих факторов, связанных с ростом асцитной формы опухоли, животные погибают.
Из только что сказанного становится ясным, что какой-либо один, отдельно взятый показатель роста асцитных форм опухолей не может достаточно исчерпывающе отразить этот рост, а также влияние на него химиотерапевтических агентов. Какие же критерии роста асцитных форм можно рекомендовать?
Вес животных при прививке им асцитных форм опухолей имеет несколько иное значение, чем при прививке опухолей под кожу: гибель животных с асцитными опухолями наступает в более короткие сроки (7—10—15 дней) и прибавка в весе в основном обусловлена накоплением жидкости и опухолевых клеток в брюшной полости. Поэтому, взвешивая животных до прививки и каждые 2—3 дня после прививки, мы можем по меньшей прибавке в весе животных подопытных групп судить о терапевтическом эффекте.
Объем асцитической жидкости является другим показателем роста асцитных форм опухолей, однако при этом следует помнить о двух обстоятельствах: 1) объем асцитической жидкости следует определять только в конце опыта, так как периодическое опорожнение брюшной полости (что технически вполне возможно) может исказить результаты опыта; 2) количество опухолевых клеток в равном объеме асцитической жидкости у разных животных может быть различно.
Концентрация опухолевых клеток в 1 мм3 асцитической жидкости, что легко определить подсчетом, например, в камере Горяева, также может служить показателем роста опухоли, но и этот критерий не может быть единственным. Это обусловлено уже упомянутой неоднородностью клеточного состава асцитической жидкости, разной потенцией к росту у разных типов опухолевых клеток и большой примесью неопухолевых элементов. Поэтому подсчет числа клеток в 1 мм3 асцитической жидкости требует параллельного изучения цитограмм на окрашенных мазках. Такое исследование в свою очередь предполагает твердое знание цитологических особенностей каждой асцитной опухоли, чего в настоящее время еще нет. Кроме того, число клеток в 1 мм3 асцитической жидкости варьирует от целого ряда причин, в частности от числа клеток в инокуляте, что требует прививки большого числа животных одинаковым числом клеток.
В настоящее время ряд авторов предлагает в качестве более надежного критерия роста асцитных форм опухолей среднюю общую массу или средний объем клеток в асцитической жидкости. Эти показатели определяются следующим образом. Животное в конце опыта убивают, опорожняют брюшную полость и взвешивают (или измеряют) асцитическую жидкость. Затем ее центрифугируют и определяют вес (или объем) центрифугата в процентах от общего веса (объема) асцитической жидкости. Конечный показатель, т. е. общая масса или общий объем клеток, является произведением общего веса (объема) асцитической жидкости на вес (объем) клеток в процентах от веса (объема) всей асцитической жидкости. Таким образом, этот показатель сразу учитывает как величину асцитической жидкости, так и концентрацию клеток в ней.
Поскольку конечным результатом роста асцитной опухоли является гибель животного, то наиболее общим показателем терапевтического действия вещества является излечение или большая по сравнению с контролем длительность жизни подопытных животных. Этот показатель достаточно надежен, но при условии, что выбранный для исследования штамм асцитной опухоли вызывает гибель всех животных, а отклонения в сроках гибели отдельных животных от средней невелики.
в) Лейкозы
После прививки лейкозных клеток у животного наблюдаются многочисленные проявления злокачественного роста: развитие опухолевого узла в месте прививки, увеличение лимфатических узлов и селезенки, инфильтрация лейкозными клетками печени, почек и других внутренних органов, увеличение количества лейкоцитов в крови и появление в ней лейкозных клеток, характерных для данного штамма. Хотя все эти проявления могут изучаться в опытах и служить показателями действия химиотерапевтических веществ на лейкоз, все они крайне вариабильны и часто не совпадают друг с другом. Так, например, при прививке одного и того же штамма лейкоза (и даже одинаковым количеством клеток) у одного животного количество лейкоцитов может достигнуть сотен тысяч, а у другого оставаться в пределах нормы. Однако эти животные могут погибнуть от лейкоза в один и тот же день, а на вскрытии мы обнаружим одинаковую степень инфильтрации внутренних органов. Наоборот, животные с одинаковым числом лейкоцитов в крови могут быть.в различной степени поражены лейкозом и погибнуть в разные сроки.
Поэтому, не исключая подробных гематологических и патологогистологических исследований и сопоставления различных показателей при использовании веществ, противолейкозная активность которых установлена, мы считаем, что о терапевтическом эффекте вновь исследуемых веществ можно говорить лишь в том случае, если они увеличивают длительность жизни подопытных животных. Следует подчеркнуть, что для химиотерапевтических опытов подобного рода необходимо выбирать такой штамм лейкоза, который вызывает гибель всех привитых животных.
Спектр противоопухолевого действия
Мы уже говорили о том, что между чувствительностью к противоопухолевым агентам гистогенетически близких опухолей человека и животных нет параллелизма. Этот факт ни в коем случае не может служить доказательством того, что между опухолями человека и животных вообще нет сходства по такому признаку, как чувствительность к химиотерапевтическому воздействию. Видимо, причина одинаковой (или разной) чувствительности опухолей определяется не только их гистогенетическими особенностями, но и другими свойствами, например сходством (или разницей) в обмене веществ. Последнее соображение заставляет, помимо изучения обмена веществ опухолей, испытывать новые химиотерапевтические препараты на возможно большем числе опухолей животных и человека и все время сопоставлять результаты, полученные в эксперименте и клинике.
Однако есть и другие соображения в пользу испытания веществ на большем наборе экспериментальных опухолей, прямо вытекающие из задач отбора новых противоопухолевых агентов. Прежде всего известно, что многие противоопухолевые препараты, уже оправдавшие себя в клинике, угнетают рост не всех, а лишь нескольких или даже какой-либо одной перевиваемой опухоли животных. Следовательно, испытывая действие новых соединений на одну или небольшое число опухолей, мы рискуем пропустить вещество, обладающее противоопухолевой активностью по отношению к опухоли, почему-либо не попавшей в выбранный для исследования ряд.
Другим соображением в пользу применения широкого спектра опухолей при отборе является то, что практическую ценность могут представить не только соединения, обладающие большим действием на какую-либо опухоль, чем ранее изученные вещества, но и отличающиеся от последних по широте спектра противоопухолевого действия.
Если необходимость исследования действия вещества на возможно больший спектр опухолей не вызывает сомнений, то практически осуществить это очень трудно. Поэтому вполне понятны попытки выделить те опухоли, испытание на которых целесообразно провести в первую очередь.
Однако единого мнения по этому вопросу до сих пор нет. Некоторые исследователи считают возможным при первичных испытаниях ограничиться одной опухолью. Например, английские исследователи в основном отбирают вещества, обладающие противоопухолевой активностью, в опытах на крысах с карциномой Уокера 256. В США такой излюбленной опухолью является мышиная саркома 180 (Крокера), а в Японии — крысиная саркома Иосида. В США Национальный центр по химиотерапии рака рекомендовал для первичного отбора три опухоли мышей: аденокарциному 755, саркому 180 и лейкемию L-1210. Однако дискуссия по поводу этой рекомендации показала, что большинство исследователей считают, что применение этих трех опухолей не избавляет от риска пропустить активный препарат.
Обсуждение вопроса о спектре опухолей для химиотерапевтических исследований на II Всесоюзном координационном совещании по химиотерапии рака (Москва, 1958) также не привело к выработке единого мнения. Подобная ситуация объясняется малой изученностью вопроса и отсутствием достаточно надежных методов сравнительной оценки противоопухолевого действия.
Таким образом, дать уже оправдавший себя список опухолей для изучения спектра противоопухолевого, действия химиотерапевтических агентов в настоящее время нет возможности и мы в состоянии высказать лишь наше личное мнение. Нам кажется, что на первом этапе исследований можно ограничиться тремя опухолями: крысиной саркомой 45, крысиной карциномой Уокера 256 и мышиной саркомой 180. Предпосылки для выбора именно этих опухолей следующие.
Карцинома Уокера чувствительна к самым разнообразным соединениям и позволит не пропустить вещество со слабой активностью. Саркома 45 неодинаково чувствительна к разным соединениям из группы алкилирующих агентов (от отсутствия эффекта до рассасывания опухолей у всех животных) и позволит ориентироваться в ценности нового вещества этого класса. Наконец, саркома 180 малочувствительна к алкилирующим агентам и сильное угнетение ее роста веществом из этой группы будет говорить о значительном отклонении в спектре противоопухолевого действия нового препарата по сравнению с ранее изученными. В то же время саркома 180 чувствительна к различного рода антиметаболитам; имеется некоторый параллелизм между действием веществ на эту опухоль и на лейкозы человека.
Использование лекарственноустойчивых вариантов опухолей
Сравнительно недавно было доказано, что в результате химиотерапии опухоль может приобрести лекарственную устойчивость к действовавшему на нее агенту. В настоящей статье мы не можем остановиться ни на значении лекарственной устойчивости опухолей для химиотерапии рака, ни на методах изучения этой проблемы. Однако некоторые особенности возникающей лекарственной резистентности опухолей позволяют использовать этот феномен уже при первичном отборе противоопухолевых соединений.
Так, возникшая в результате лечения резистентность является свойством самих опухолевых клеток, стабильна и сохраняется при перевивке здоровым животным, т. е. возникает устойчивый вариант перевиваемой опухоли. Этот вариант, как правило, устойчив не только к тому агенту, к которому возникла устойчивость, но и ко всем соединениям одинакового механизма действия. Наконец, возникшая устойчивость специфична и не распространяется на вещества, имеющие другой механизм действия, чем вызвавший ее агент. Таким образом, поставив с новым веществом опыты на животных с вариантом опухоли, устойчивым к какому-либо соединению, мы можем быстро ориентироваться в механизме действия этого нового вещества. Действие вещества на опухоль, ставшую резистентной к определенному классу соединений, может открыть новый тип противоопухолевых веществ, что чрезвычайно важно, если помнить о возможности комбинированной химиотерапии опухолей.
Правда, число лекарственноустойчивых вариантов опухолей еще невелико. Однако уже в настоящее время мы можем рекомендовать полученные в Институте экспериментальной и клинической онкологии АМН СССР Л. Ф. Шарликовой варианты саркомы 45, устойчивые к допану и сарколизину. Эти варианты прошли уже свыше 50 генераций, отличаются от исходной опухоли как морфологически, так и биохимически, перекрестно резистентны к другим хлорэтиламинам и этилениминам, изученным в институте, и сохраняют чувствительность исходной опухоли к веществам другого, чем хлорэтиламины и этиленимины, механизма действия (омаин).
Некоторые статистические проблемы
В этом разделе мы укажем лишь на некоторые из затруднений, возникающих при оценке результатов химиотерапевтического опыта и требующих статистического подхода при их решении. Было бы слишком самонадеянным для биолога провести анализ всех предложенных выше критериев опухолевого роста с позиций статистической науки: это явно выходит за пределы нашей компетенции. Можно лишь сожалеть, что до сих пор статистики слишком мало уделяют внимания такой важной области исследований, как экспериментальная терапия рака, так как только в содружестве с ними экспериментатор может избежать те «подводные камни», которые скрываются как в особенностях объекта исследования, так и в специфических условиях работы по массовому отбору противоопухолевых веществ.
Главное затруднение, которое возникает при оценке результатов, объясняется большой вариабильностью роста перевиваемых опухолей: при прививке одним и тем же материалом опухоли у отдельных животных по своим размерам и весу могут отличаться друг от друга в десятки раз. Можно было бы для каждого штамма при большом числе наблюдений установить как среднюю величину или вес опухоли на определенный день после перевивки, так и всю кривую вероятности отклонений от средней на любую величину. Однако рост перевиваемых опухолей может быть различен в разные сезоны года, у животных разного пола и возраста и даже в одно и то же время у двух однородных групп животных, если одна из них привита материалом одной опухоли предыдущего пассажа, а другая — материалом другой опухоли того же пассажа. Все это заставляет каждый раз сравнивать размер или вес опухолей подопытной группы с соответствующими параметрами собственного контроля, т. е. с опухолями животных, привитых в те же сроки и тем же материалом. Но в этом случае контрольная группа не может быть слишком велика.
Наиболее убедительным показателем терапевтического эффекта является излечение животного от опухоли. При применении штаммов, не дающих случаев спонтанного рассасывания опухоли, излечение хотя бы 3—4 животных из 10 говорит об очень высокой противоопухолевой активности препарата. Результаты опытов, в которых критерием активности является излечение животных, легко проанализировать и статистически, применив хотя бы такое мерило значимости (достоверности), как х2. Однако мы не можем в поисках новых противоопухолевых веществ ориентироваться только на излечение, а потому большинство рекомендованных выше критериев носит не альтернативный (да, нет), а градационный характер.
Это значит, что, ориентируясь на среднюю величину какого-либо признака (средний диаметр, объем, вес опухолей, длительность жизни животных и т. д.) в группах, состоящих из небольшого числа животных, мы все время рискуем принять случайное расхождение средних величин за проявление терапевтического эффекта.
Для повышения убедительности полученных результатов проще всего было бы пойти по пути увеличения числа животных в группах, особенно в контрольной, но это не всегда возможно. Поэтому мы рекомендуем проводить статистическую обработку результатов опыта, вычисляя так называемую достоверность разницы между группами по видоизмененной формуле Стьюдента — Фишера. Формула и ход вычислений приведены в приложении, здесь же нужно предостеречь от двух часто совершаемых ошибок.
Первая ошибка. Например, в среднем опухоли по весу или размеру в подопытной группе меньше, чем в контрольной, на 45%, и разница статистически достоверна. В этом случае мы вправе сделать вывод, что вещество тормозит рост опухоли, так как вероятность случайного отклонения средней подопытной группы от средней контроля очень мала (при выбранном уровне достоверности Р = 0,950 вероятность случайного отклонения равна 1:20). Однако мы не можем считать, что вещество тормозит рост опухоли именно на 45%, а не больше или меньше: выбранный метод статистического анализа не может дать ответа на этот вопрос.
Вторая ошибка. Если разница между подопытной и контрольной группой статистически не достоверна, то часто делают вывод, что препарат не обладает противоопухолевой активностью. Между тем достоверность разницы, как и любое другое мерило значимости (достоверности), никогда не доказывает, что данный фактор не дал эффекта. Если разница между группами статистически не достоверна, то это показывает лишь то, что реальная разница довольно мала и в следующем опыте с таким препаратом может проявиться в направлении, противоположном тому, на которое рассчитывают.
Мы думаем, что если соблюдать указанные выше условия опыта и проводить статистический анализ полученных величин с учетом только что сделанных замечаний, то любой
исследователь может дать точный ответ о наличии или отсутствии противоопухолевого действия у какого-либо нового агента.
Гораздо сложнее обстоит дело с ответом на другой чрезвычайно важный вопрос: какой из двух или более агентов сильнее действует на опухоль. Мы уже говорили, что предлагаемый метод статистического анализа помогает доказать наличие эффекта, но не его величину. Поэтому если сравниваются два агента, один из которых тормозит рост опухоли на 70%, а другой — на 80%, причем разница в весе опухолей между контрольными и подопытными группами в обоих случаях статистически достоверна, то это еще не дает права сказать, что второй агент действует на опухоль сильнее первого.
Такой вывод мог бы быть убедительным, если бы оба препарата изучались в одном опыте, а статистически достоверной была бы разница не столько между контрольной и подопытными группами (статистический анализ которой при высоких процентах торможения не так уж обязателен), сколько разница между двумя подопытными группами.
Еще более сложным является статистический анализ результатов действия двух или более агентов на разные опухоли, особенно на опухоли разных видов животных, так как здесь возникают трудности не только статистического порядка.
Мы рекомендовали (и это целесообразно) испытывать новые вещества на наличие противоопухолевой активности, применяя их в максимальной переносимой дозе (ДПМ) или в дозе, чуть ниже ДПМ, — так называемой максимальной терапевтической дозе (ДТМ). Величина этих доз определяется, особенно в первых опытах, с относительной точностью. Следовательно, даже при статистической достоверности разницы в действии двух препаратов, один из которых тормозит рост опухоли на 70%, а другой — на 80%, мы не можем поручиться за то, что второй препарат активнее первого, так как возможно, что второй агент был взят в несколько большей дозе, чем первый.
При переходе к опытам на другом виде животных положение еще более осложняется, так как разные виды животных могут иметь разную чувствительность к одному и тому же соединению, а для двух веществ эта разница в видовой чувствительности может быть неодинаковой и даже противоположной. Поэтому механический перенос дозировок, полученных в опытах на одном виде, на другой вид не только не позволяет провести достаточно полноценное сравнение препаратов между собой (например, по спектру противоопухолевого действия), но и может исказить действительное положение вещей.
Из всего сказанного становится ясным, что два или более препарата можно сравнивать между собой или по противоопухолевому действию доз, оказывающих одинаковое влияние на организм, или по действию на организм доз, дающих одинаковый противоопухолевый эффект. Это значит, что при сравнении противоопухолевых агентов решающее значение имеет не абсолютная, а относительная величина дозировок, например величина доз двух сравниваемых препаратов по отношению к их ДЛ50. В то же время для сравнения препаратов по относительной величине доз, эквивалентных по эффекту, необходимо знать для каждого препарата зависимость между величиной дозы и величиной эффекта, т. е. возникает необходимость изучения противоопухолевого действия каждого препарата не в одной, а в нескольких дозах. При сравнении действия аналогов или гомологов какого-либо вещества, а также веществ с одинаковой функциональной группой и механизмом действия возникает необходимость изучения их действия в эквимолекулярных концентрациях.
Изложенные здесь принципы сравнительной количественной оценки биологического действия веществ хорошо известны и применяются не только в токсикологии и фармакологии, но и в химиотерапии инфекций. Однако в экспериментальной химиотерапии опухолей разработка методов количественной оценки только начинается.
Сравнительная количественная оценка противоопухолевого действия
При оценке перспектив практического использования новых противоопухолевых агентов решающее значение имеет специфичность, избирательность их действия на опухоль. В то же время сопоставление по этому свойству веществ определенной химической структуры позволяет рационально подойти к синтезу более избирательно действующих соединений. Поэтому количественная оценка противоопухолевого действия — это прежде всего оценка избирательности действия различных соединений. Важным, хотя и не единственным, показателем избирательности действия является соотношение между токсичностью и лечебным действием, или, точнее, соотношение между дозировками, вызывающими токсический и терапевтический эффект.
Как это было показано в предыдущем разделе, при сравнении относительного действия двух или более препаратов обязательным условием является выбор доз, эквивалентных по эффекту (токсическому или противоопухолевому). Изложенные выше методы исследования противоопухолевого действия не отвечают этому требованию, так как они не вскрывают зависимости величины эффекта от величины дозы.
В этом разделе мы на конкретном материале попытаемся осветить некоторые пути решения проблемы количественной оценки противоопухолевого действия и более подробно разобрать предложенный нами ранее метод оценки, который на данном этапе развития теоретических основ химиотерапии опухолей кажется нам приемлемым. При изложении методов определения токсичности было сказано о том, что ДЛ50 можно установить методом интерполяции, построив кривую зависимости токсического (летального) эффекта от дозы. Ту же самую зависимость от дозы можно определить и для противоопухолевого эффекта, поставив опыты с рядом возрастающих доз.
Опыт работы показал хорошую повторяемость результатов при только что изложенном методе исследования, т. е. кривые зависимости противоопухолевого действия от дозы сохраняли свое место в системе координат и свой характер при повторных определениях. Можно было бы привести ряд примеров, показывающих, что кривая зависимости действия от дозы более полно отражает противоопухолевые свойства соединения, чем результаты испытания его в какой-либо одной дозе.
Построив кривые зависимости противоопухолевого действия от дозы для нескольких соединений, мы можем методам интерполяции определить для каждого из них дозы, эквивалентные по эффекту. Однако простое сопоставление этих доз не позволит оценить степень избирательности действия каждого из препаратов, так как для такой оценки важнее не абсолютная, а относительная (например, по отношению к токсичности) величина доз, дающих одинаковый противоопухолевый эффект. Для этого нужно выразить дозы каждого соединения не в абсолютных величинах (миллиграммы, граммы), а в процентах от дозы, разной для каждого препарата и вида животного, но дающей одинаковый токсический эффект, например в процентах от ДЛ50 при однократном введении.
Поскольку встречается, да и теоретически вполне возможна непрямолинейная корреляция между величиной дозы и эффекта, то сравнение двух и более препаратов по относительному положению кривой их противоопухолевого действия является более полноценным методом оценки избирательности, чем, например, по отношению двух доз, одна из которых вызывает вполне определенный токсический, а другая — вполне определенный терапевтический эффекты, т.. е. по химиотерапевтическому индексу. Однако в ряде случаев такая относительная величина, как химиотерапевтический индекс, не заменяя более глубокий анализ избирательности действия, является очень удобным показателем.
Так, например, изучая зависимость противоопухолевого действия от изменения химической структуры веществ с одинаковой функциональной группой (роль радикала или замещений в кольце и в боковых цепях), от физико-химических свойств, от распределения и судьбы веществ в организме и т. д., чрезвычайно удобно выразить избирательность действия какой-либо одной цифрой. Это удобно и при изучении спектра противоопухолевого действия одного или нескольких препаратов, а также при оценке степени лекарственной устойчивости, возникшей у одной опухоли к разным препаратам или у разных опухолей к одному препарату. Однако прежде чем рекомендовать какой-либо метод вычисления химиотерапевтического индекса, нам кажется необходимым привести некоторые соображения принципиального характера.
Химиотерапевтический индекс, как уже было сказано выше, это отношение дозы, вызывающей определенный токсический эффект, к дозе, вызывающей определенный терапевтический эффект. Но эффекты (токсический и терапевтический) могут быть разными или могут быть получены при разных условиях (например, при однократном и многократных введениях). Следовательно, возникает вопрос о выборе величины эффектов и условий их получения, которые бы определяли числитель и знаменатель дроби, представляющей собой химиотерапевтический индекс, т. е. возникает вопрос, что к чему относить.
Прежде всего следует указать на полную несостоятельность (как химиотерапевтического индекса) такого отношения, как ДЛ50 при (Многократном введении к ДПМ (ДТМ) при тех же условиях введения. Действительно, ДПМ (ДТМ) является дозой, выражающей токсические свойства препарата, а не его терапевтический эффект. Поэтому отношение ДЛ50 ДПМ в данных условиях есть отношение двух величин (точек) одной и той же кривой зависимости токсического эффекта от дозы.
Больший смысл имело бы отношение ДЛ50 при однократном введении к ДПМ (ДТМ) при многократных введениях, так как оно указывало бы на степень кумуляции препарата. В этом случае чем меньше величина отношения (индекс), тем, следовательно, меньше выражены кумулятивные свойства. Но, во-первых, величина этого индекса ничего не говорит об избирательности действия на опухоль, во-вторых, у всех известных противоопухолевых агентов нет принципиальной разницы в действии на опухоль и на нормальные ткани организма: их клиническое применение возможно лишь благодаря количественным различиям в чувствительности к ним опухолевых и нормальных клеток. Поэтому в химиотерапии опухолей остается неясным, являются ли высокие кумулятивные свойства вещества положительным или отрицательным фактором в оценке препарата как химиотерапевтического агента.
Выше уже были указаны преимущества использования ДЛ50 для характеристики токсичности препарата. Остается решить вопрос, лучше ли остановиться при определении химиотерапевтического индекса на ДЛ50 при однократном введении или на ДЛ50 при многократном введении и следует ли определять ДЛ50 на интактных животных или на животных с опухолями.
Нам кажется, что наиболее целесообразно остановиться на ДЛ50 при однократном введении здоровым, интактным животным как на дозе, характеризующей токсичность препарата, так сказать, в чистом виде. Действительно, при определении ДЛ50 при многократных введениях здоровым животным (даже если мы точно договоримся о числе и частоте введений) на величину этой дозы будут влиять кумулятивные свойства препарата, а значения этих свойств для проявления противоопухолевого действия мы не знаем. Разумеется, определение степени кумуляции токсического эффекта какого-либо вещества, в том числе и противоопухолевого, является очень важной характеристикой его фармакологических свойств, но нам кажется, что лучше этот вопрос решать особо, тем более что методы решения его не имеют никакой онкологической специфики.
Что же касается определения ДЛ50 на животных с опухолями, то оно трудно выполнимо, да и ненужно. Мы уже указывали, что чувствительность к ядам животных с разными опухолями может быть различной, а специфическое действие вещества на опухоль учитывается знаменателем химиотерапевтического индекса — дозой, дающей определенный противоопухолевый эффект. Поскольку нас мало интересует величина химиотерапевтического индекса отдельно взятого соединения и этот показатель необходим нам лишь для сравнения препаратов между собой, то мы вправе (если оставить в стороне вопрос о случаях непрямолинейной зависимости эффекта от дозы) выбрать любую величину эффекта для определения знаменателя химиотерапевтического индекса. Однако легко понять, что чем меньший эффект мы выберем для определения знаменателя химиотерапевтического индекса, тем больше будет величина индекса. Мы остановились на дозе, вызывающей (по весу) 50% торможения роста опухоли — ДПО50 («доза противоопухолевая — 50%»).
ДПО50 избрана, исходя не из теоретических, а из практических соображений. Дело в том, что 50% торможения роста опухоли, определяемое по весу, — это вполне реальное и для большинства штаммов статистически достоверное угнетение.
При использовании ДЛ50 и ДПО50 формула химиотерапевтического индекса будет: I50 = ДЛ50 / ДПО50
Если бы мы выбрали дозу, дающую больший эффект, например 90% торможения, то химиотерапевтический индекс (I90) мог бы найти применение лишь для ограниченной группы соединений.
Второй пример касается применения химиотерапевтического индекса для сопоставления избирательности действия с другими свойствами соединений. Из таблицы видно, что у 4 хлорэтиламинов имеется известный параллелизм в степени подвижности атома хлора (скорость гидролиза), длительности циркуляции в крови в активном состоянии и избирательностью действия на саркому 45, т. е. можно думать, что для проявления противоопухолевого действия благоприятно длительное присутствие препарата в крови, а это свойство в свою очередь зависит от физико-химических свойств соединения.
Применяя для оценки противоопухолевого действия препаратов ДПО50 в качестве знаменателя химиотерапевтического индекса, мы избегаем ошибки, возможной при применении для такой оценки эффекта от ДПМ, но не устраняем трудностей, связанных с вариабильностью роста перевиваемых опухолей. Действительно, если одна и та же доза в разных опытах может дать разный процент торможения роста опухоли, то и ДПО50 (а следовательно, и I50), определяемая в разных опытах, может оказаться разной.
Небольшая разница в величине химиотерапевтического индекса не позволяет сделать вывод о том, что один препарат лучше (т. е. действует на опухоль более избирательно), чем другой. Для этого понадобилось бы или большое число повторных определений, или специальный статистический анализ достоверности разницы в значении индекса.
Меньше опасность принять случайную разницу между противоопухолевым действием двух соединений при сравнении их то кривой зависимости эффекта от дозы. Действительно, если мы сравниваем действие двух препаратов на какую-либо опухоль в таких пяти дозах, как 0,5, 1, 3, 5 и 10% от ДЛ50, и один из препаратов в каждой из выбранных доз дает больший эффект, то мы вправе иначе подойти к статистическому анализу полученных результатов, а именно: считать, что один из препаратов при прочих равных условиях дает больший эффект и в 5 случаях из 5.
Можно повысить убедительность результатов сравнения противоопухолевого действия нескольких соединений, если сравнивать их в одном опыте с общей и достаточно большой контрольной группой (см. выше). При попытках доказать, что новое вещество из известной группы соединений более избирательно действует на какую-либо опухоль, необходимо определить его действие в одном опыте с наиболее активным из уже известных веществ этой группы. Только в там случае, если новое соединение во всех дозировках (взятых для обоих препаратов как равные доли от их ДЛ50) дает больший эффект, чем препарат, взятый для сравнения, можно говорить о преимуществах нового вещества.
Тактика исследования
Изложенные в предыдущих разделах методы изучения соединений с предполагаемым противоопухолевым действием во всей их полноте должны применяться лишь по отношению
к тем веществам, которые уже по предварительным данным представляют теоретический интерес или есть надежда на их клиническое применение. Во многих же случаях можно значительно сократить сроки изучения новых веществ, если отчетливо представлять себе те конкретные задачи, которые стоят на разных этапах исследования. Для того чтобы пояснить нашу тактику при отборе веществ с противоопухолевой активностью, разберем схему, где поэтапно представлено изучение гипотетических препаратов А, В и С с вымышленными дозами и эффектами.
Допустим, что о вновь синтезированных веществах А, В и С нам известно лишь то, что первые два относятся к хорошо изученной группе алкилирующих агентов (А — этиленимин, Б — хлорэтиламин), а последний (С) исследуется как возможный антиметаболит (например, аналог незаменимой аминокислоты).
Для того чтобы ориентироваться в токсичности этих веществ, мы однократно вводим их в двух далеко отстоящих друг от друга дозах, например 2 и 100 мг/кг, взяв на испытание каждой дозы по 3 крысы. Допустим, что препарат А вызвал гибель всех животных как в дозе 2 мг/кг, так и в дозе 100 мг/кг. В этом случае мы уже достаточно ориентированы в высокой токсичности препарата А и можем поставить опыт с большим числом животных (по 10 в группе) и с большим числом доз (три). Такой опыт может дать нам результаты, показанные во втором прямоугольнике схемы; они достаточны, чтобы методом интерполяции определить ДЛ50.
Препарат В, как видно на схеме, вызвал гибель всех трех животных, получивших его в дозе 100 мг/кг (на схеме для наглядности 100% гибели, хотя вычислять процент по 3 животным рискованно) и не вызвал гибели в дозе 2 мг/кг. Полученные сведения хотя и ориентируют нас в токсичности препарата В, но недостаточны, чтобы поставить опыт на большом числе животных. В этом случае целесообразно вновь поставить опыт на небольшом числе животных, но уже с другими дозами и затем, если будут получены соответствующие результаты (второй прямоугольник для В), провести опыты, позволяющие определить ДЛ50 для препарата В (третий прямоугольник схемы).
Для ориентировки в токсичности препаратов А и В понадобилось соответственно 36 и 42 крысы, 53 и 143 мг веществ (предполагая, что каждая крыса весила 150 г) и 2 и 3 недели времени, если ставить следующий опыт через неделю после постановки предыдущего.
Препарат С, как видно из схемы, оказался малотоксичным: крысы, получившие его даже в дозе 100 мг/кг, не погибли. В этом случае целесообразно испытать на 3 животных дозу, во много раз превышающую 100 мг/кг, например 1000 мг/кг. Если эта доза, как показано на схеме, вызвала гибель 2 животных из 3, то на этом ориентировку в токсичности приходится закончить, так как иначе мы рискуем вступить в конфликт с химиками-синтетиками. Действительно, еще не известно, обладает ли препарат С какой-либо противоопухолевой активностью, а мы уже на 9 крыс израсходовали около 500 мг препарата.
Определив ДЛ50 препаратов А и В и считая, что ДЛ50 препарата С находится где-то в пределах от 700 мг/кг до 1000 мг/кг, мы уже можем поставить на небольшом числе животных (5 и 5) первый опыт по определению противоопухолевой активности, вводя эти препараты в дозе, равной примерно 1/6 ДЛ50 (см. первый прямоугольник второй части схемы).
Допустим, что препарат А вызвал торможение роста саркомы 45 на 80%, но выбранная доза (0,25 мг/кг) при 20-кратном введении привела к гибели 2 крыс из 5. Препарат В в дозе 2,4 мг/кг вызвал рассасывание опухолей у всех животных подопытной группы (100% торможения), причем все 5 крыс остались живы. Наконец, препарат С в дозе 150 мг/кг после 20 введений затормозил рост саркомы 45 только на 30%, что при числе животных 5 в группе статистически, как правило, не достоверно. К тому же препарат С вызвал гибель одной крысы из 5. Уже этот первый опыт ориентировал нас в противоопухолевой активности препаратов, и можно сделать следующее заключение: препарат А резко угнетает рост саркомы 45, но вряд ли может привести к излечению даже в токсических дозах, препарат В, возможно, превосходит по противоопухолевой активности ранее изученные хлорэтиламины, а препарат С обладает очень слабым действием на эту опухоль.
Если учитывать изложенные выше методы сравнительной оценки и данные о противоопухолевом действии других соединений, то тактика дальнейших исследований такова. С препаратом А можно было бы поставить еще один опыт на крысах с саркомой 45 по плану, изображенному в пунктирном прямоугольнике схемы, но это кажется уже нецелесообразным. Действительно, больше 80% торможения мы вряд ли получим, а это значит, что препарат А по своему действию на саркому 45 стоит ниже целого ряда уже известных препаратов. Поэтому более правильно с точки зрения экономии времени, препарата и животных, перейти к опыту на другом штамме — саркоме 180. На схеме это показано обводной жирной стрелкой. Так как .мы переходим к опытам на другом виде животных, то целесообразно было бы поставить опыт на токсичность на небольшом количестве мышей. Можно поступить и иначе, взяв в опыте на мышах 3 дозы: 0,25 мг/кг и по одной дозе выше и ниже. Допустим, что мы получим результаты, изображенные на схеме (нижний прямоугольник), т. е. доза 0,35 мг/кг препарата А затормозила рост саркомы 180 на 47% и вызвала гибель 20 мышей из 10. Уже в начале разбора этой примерной схемы мы исходили из того, что препарат А является зтиленимином. Зная это, вряд ли можно ожидать, что это соединение, будучи менее активным по отношению к саркоме 45 и саркоме 180, чем целый ряд других этилениминов, окажется значительно активнее их на каком-либо другом штамме. Хотя такая возможность не исключена, но если есть более важная работа, то исследование препарата А можно прекратить.
Препарат В, хлорэтиламин, в первом опыте оказался эффективным в отношении саркомы 45; с этим препаратом целесообразно повторить опыт на животных с тем же штаммом, но с большим числом животных и с несколькими дозами, чтобы построить кривую зависимости противоопухолевого действия от дозы и сравнить этот препарат с другими высокоактивными препаратами, например, по химиотерапевтическому индексу. Если результаты окажутся такими, как это изображено на схеме (I50 =100), то дальнейшая судьба этого препарата (клинические испытания) зависит от патоморфологических, гематологических и фармакологических исследований. Пока проводятся эти исследования, необходимо поставить более развернутые сравнительные опыты и изучить спектр противоопухолевого действия.
Наконец, препарат С, предполагаемый антиметаболит, в предварительном опыте оказал очень слабое влияние на саркому 45. Учитывая другой, чем у препарата А и В, механизм его действия, в дальнейшем целесообразно уточнить эффект, даваемый этим препаратом на саркоме 45, поставив опыт на большем числе животных (в данном случае не менее чем 20 в группе) по плану, изображенному в пунктирном прямоугольнике. Однако с препаратом С выгоднее провести тот же обходной маневр, что и с препаратом А, но уже по другим соображениям. Допустим, что после предварительного опыта на животных с саркомой 45 мы поставили опыт на мышах с саркомой 180 и получили результаты, изображенные в нижнем прямоугольнике схемы. Последний опыт, учитывая пока еще неизвестный, но, видимо, отличный от других веществ механизм действия этого препарата, дает нам право перейти ко второму этапу исследования. На этом этапе, помимо уточнения данных токсичности, патоморфологических исследований и изучения действия на систему крови, необходимо обратить внимание на действие препарата С на варианты опухолей с лекарственной устойчивостью к другим соединениям и на возможность использования препарата С в комбинации с другими противоопухолевыми агентами.
Настоящая статья никоим образом не исчерпывает все возможности экспериментального изучения веществ с предполагаемой противоопухолевой активностью. Основное внимание было уделено методике исследований на животных с перевиваемыми опухолями, которая в настоящее время является не только наиболее разработанной, но и дающей наиболее точный и надежный ответ из всех других методов изучения противоопухолевых агентов. Однако даже методы исследований на животных с перевиваемыми опухолями мы не могли изложить со всей полнотой. В частности, мы опустили такой важный раздел, как эксперименты по комбинированной химиотерапии опухолей. Методика этих экспериментов и особенно количественная оценка комбинационного эффекта довольно сложны и специфичны. Здесь мы можем лишь указать на то, что существуют три метода количественной оценки комбинационного эффекта, подробное описание которых читатель может найти в работах Стока, Мантеля и И. Б. Сорокиной.
Питание при раке
Каким должно быть питание при онкологических заболеваниях? Какие продукты абсолютно противопоказаны при той или иной форме рака?
ПРИЧИНЫ И СИМПТОМЫ
