Некоторые общие сведения о полярографическом методе
Одним из методов распознавания злокачественных опухолей является полярография. Полярографический метод диагностики злокачественных опухолей не может применяться как самостоятельный метод. Однако он с успехом может быть использован в комплексе с клиническим, рентгенологическим, цитологическим и другими методами диагностики для выявления рака, особенно внутренних органов, в равней стадии его развития.
Полярография — это электрохимический метод качественного и количественного анализа химических веществ. Весьма большая чувствительность полярографического метода дает возможность определять вещества в растворе в самых незначительных концентрациях (до 0,0001 %). В некоторых случаях она значительно превышает чувствительность спектрального анализа. Для выполнения анализа достаточно нескольких минут.
Полярографический анализ проводится путем электролиза исследуемого вещества в растворе. Сущность полярографического анализа состоит в получении и расшифровке кривых зависимости силы тока от постепенно изменяющегося напряжения. Для получения кривых (сила тока — напряжение) постепенно увеличивают напряжение на электродах и измеряют силу тока по показаниям гальванометра. На рисунке показана кривая зависимости силы тока от постепенно увеличивающегося напряжения. Такая кривая называется полярографической волной. На рисунке приведена простейшая схема полярографической установки с ртутным капельным электродом для получения кривых зависимости силы тока от постепенно увеличивающегося напряжения.
Как видно из схемы, Э (электролизер) с исследуемым раствором соединяется через ртутный капельный электрод К (катод), с гальванометром Г, а затем с аккумулятором АК и потенциометром П. Вторым электродом (анодом) служит неподвижный слой ртути А, находящийся на дне электролизера. Анод соединен посредством движка с потенциометром и аккумулятором. При полярографическом анализе снимаются кривые или так называемые подпрограммы.
Полярограф и принцип работы с ним
Прибор, автоматически записывающий на фотобумаге кривые силы тока и напряжения, называется полярографом. Общий вид полярографа, выпускаемого ленинградским заводом. При полярографировании удобнее всего пользоваться в качестве электролизера одинаковыми небольшими толстостенными стаканчиками, специально сделанными для этой цели. Во время поляро-графирования стаканчик подвешивается (надевается) на специально подобранную для него пробку, верхняя часть которой зажата в штативе. Одной из важнейших частей полярографической установки является капельный электрод. Для капельного электрода чаще сего применяются стеклянные капилляры длиной 0,5—0,7 см с внутренним просветом в 0,04—0,08 мм.
Капилляры обычно изготовляются из термометрических трубок следующим образом. Термометрическую трубку равномерно нагревают на сильном огне до размягчения, затем вынимают из пламени и энергичным движением растягивают в тонкий капилляр. После охлаждения растянутую трубку разрезают посредине. Приготовленный капилляр при помощи резиновой или хлорвиниловой трубки присоединяют к бюретке, в нижней части которой впаяна стеклянная трубка. Последняя соединена с грушеподобным резервуаром емкостью 50—100 мл, сделанным из толстостенного стекла, который в дальнейшем заполняется ртутью.
Резервуар с ртутью закрепляют в штативе при помощи кольца. Кольцо необходимо обмотать резиновой трубкой или выложить внутри пробкой. Штатив должен иметь высоту 45—60 см. После присоединения капилляра и резервуара к бюретке, заполнения его ртутью, последний закрепляют при помощи кольца на нужной высоте штатива, а затем путем опускания бюретки с ртутью кончик капилляра погружают в воду и наблюдают за скоростью падения капли (время образования капли - 2 сек.). Если скорость образования капель больше 2 сек., то, поднимая бюретку, вынимают из воды капилляр, делают на нем надрез на незначительном расстоянии от конца (маленьким напильником или специальным ножиком) и кончик отламывают, затем снова опускают бюретку и повторяют определение, пока не получат желаемый результат.
Капилляры, из которых ртуть вытекает со скоростью меньше 1 сек. для работы неудобны. Толстостенный капилляр весьма прочный и при надлежащих условиях работы служит очень долго. Как видно из рисунка, бюретка с капилляром и пробка зажаты зажимами и находятся в штативе в неподвижном состоянии. В резиновой пробке сделано два отверстия. В одно из отверстий вставлен капилляр. В случае необходимости капилляр совершенно свободно (вместе с бюреткой) можно опускать, поднимать или вынимать. В другое отверстие плотно вставлена стеклянная трубка с впаянным платиновым контактом, в которую наливается ртуть, служащая контактом между анодом (большое количество ртути, находящееся на дне электролизера) и соответствующей аппаратурой. Нужная высота ртути в бюретке регулируется путем опускания и поднимания резервуара с ртутью.
После окончания работы стаканчик (электролизер) с исследуемым раствором снимают и вместо него надевают на пробку другой такой же стаканчик с дестиллированной водой. Грушу с ртутью опускают до прекращения капания ртути.
Перед началом исследования резервуар с ртутью поднимают до ранее установленной высоты (метка на бюретке). При поднимании резервуара до намеченной метки ртуть будет капать в исследуемый раствор с нужной, ранее установленной, скоростью. Так как предельный ток и высота волны зависят не только от концентрации, температуры и проч., но и от скорости капания ртути, то из этого следует, что при количественных определениях скорость капания ртути должна сохраняться постоянной, т. е. высота ртути над капилляром во время исследования должна всегда находится на одном уровне, потому что от высоты столба ртути над капилляром зависит скорость капания.
Ртуть, применяемая в полярографии для капельного электрода, должна быть совершенно чистой. Для этой цели ее после обычней химической очистки (разведенной азотной кислотой) подвергают перегонке в вакууме. Применяемая для анода ртуть (донный электрод) не требует такой тщательной очистки.
При монтировании полярографической установки необходимо выбрать место для полярографа, установить гальванометр на капитальной стене, а затем к соответствующим клеммам полярографа подключить гальванометр, аккумулятор, электролизер и источник переменного тока. Исследуемый раствор наливают в электролизер и соответствующим образом, как это было указано ранее, погружают в него электроды, затем поднимают резервуар с ртутью над капилляром до нужной высоты, закрепляют его в штативе и еще раз проверяют скорость образования капель.
Перед началом записи кривых на фотобумагу необходимо включить напряжение выключателем «переменный ток», при этом зажигается левая сигнальная лампочка и лампа осветителя. Затем включают постоянный ток, центральный переключатель ставят в положение «напряжение полное» и ручками «постоянный ток» устанавливают стрелку вольтметра в положение, указанное красной чертой, что соответствует напряжению поляризации 4 вольта на всем потенциометрическом барабане. После этого центральный переключатель опять ставят в положение «напряжение поляризации», включают гальванометр и электро корректор. Перед включением гальванометра необходимо ручку шунта поставить на минимальную чувствительность (2000).
В дальнейшем необходимо отрегулировать «зайчик» так, как указано в описании полярографа СГМ-8, чтобы он попал в щель барабана и на матовой визуальной шкале получилось четкое изображение его в виде светящейся черты. Для того чтобы получить полярограмму на фотобумаге, необходимо подобрать шунтом такую чувствительность, чтобы вся кривая поместилась на расстоянии от 0 до 12 см (длина фотокассеты). Для этого рубку шунта перемещают с минимальной чувствительности на следующую (большую), оттягивают рычаг сцепления на правой боковой стороне полярографа и вращают ручку поляризации вправо до нужного напряжения, следя одновременно зз стрелкой вольтметра и за «зайчиком». Если при этом «зайчик» передвинулся на малое расстояние, то необходимо увеличить чувствительность, для чего ручку шунта передвигают на следующее деление до тех пор, пока не будет подобрана необходимая чувствительность гальванометра.
После того как чувствительность подобрана, ручку поляризации вращают влево до нулевого положения и нажимают рычаг сцепления. Вынимают кассету из полярографа, закладывают в нее фотобумагу (при закрытой щели) и вставляют ее обратно в полярограф. Наиболее пригодна для этой цели фотобумага № 7 или рентгеновская пленка. Установив фотокассету в нулевое положение, а «зайчик» в начале шкалы, включают правый ход мотора, левой рукой поворачивают заслонку кассеты, а правой нажимают кнопку «пуск мотора» до тех пор, пока барабан не сделает около 1/2—3/4 оборота и не станет двигаться сам. Как только «зайчик» пройдет 12 см, соответствующих длине фотокассеты, заслонку закрывают, мотор останавливают и обычным способом проявляют фотобумагу.
Микрополярограф представляет собой цельнометаллическую коробку, в которую вмонтированы: прибор для записи, гальванометр, лампа и редуктор чувствительности гальванометра. Это дает возможность пользоваться микрополярографом в любых условиях, для чего необходимо подключить к нему только аккумулятор. Потенциометрический барабан приводит в движение часовая пружина. Аппарат весит 17,7 кг и очень удобен для переноски.
Микрополярограф дает возможность получать и записывать такие же кривые, как и обычный полярограф. На рисунке показаны полярограммы, полученные при исследовании безбелкового фильтрата сыворотки крови: а) больного раком, б) здорового человека. Обе полярограммы получены при одинаковой чувствительности гальванометра (S = 1 : 100) на ленинградском полярографе.
Применение полярографического метода в диагностике злокачественных опухолей
В настоящее время полярографический метод применяется в биологии, биохимии, медицине и т. д. для разрешения различных вопросов. Работами К. Брдички, Е. Вальдшмидт-Лойца, Р. К. Фелькеля, К. Троппа, X. Грисмана, Ф. Вернгарда, Нордмарк-Верке, X. Шафера, Ф. Берга, И. Шевченко и В. Городыского, И. Юнды и других авторов доказана ценность полярографического метода для диагностики злокачественных опухолей.
Полярографическое исследование крови
Кровь больных раком отличается от крови здоровых людей высотой полярографической волны. Высота полярографической волны так называемого безбелкового фильтрата сыворотки крови больных злокачественными опухолями выше полярографической волны такого же фильтрата сыворотки крови здоровых людей. Метод полярографического исследования безбелкового фильтрата сыворотки крови заключается в том, что у больного из вены берут натощак 2—3 мл крови, оставляют ее стоять в течение 10—15 мин., а затем центрифугируют.
Для исследования берут 0,4 мл сыворотки крови и прибавляют к ней 1 мл 0,1 н. КОН. Смесь оставляют стоять в течение 30 мин., а затем прибавляют к ней 1 мл 20% раствора сульфосалициловой кислоты для удаления белков. Образовавшийся осадок отфильтровывают. Из полученного безбелкового фильтрата берут 0,5 мл раствора и добавляют к нему 5 мл контрольного раствора. Контрольный раствор приготовляют путем смешивания 10 мл 0.045 н. раствора хлористого гексаминкобальта [Co(NH3)6Cl3], 15 мл
1 н. раствора хлористого аммония, 70 мл воды и 5 мл аммиака.
В тех случаях, когда необходимо исследовать кровь у детей, можно пользоваться микрометодом. Этот метод заключается в том, что у больного из пальца при помощи иглы Франка берут микропипеткой 0,2—0,3 мл крови и помещают ее в центрифужную пробирку с оттянутым концом. Через 10—15 мин., когда кровь свернулась, ее центрифугируют.
Для исследования берут 0,04 мл сыворотки, переносят ее в другую центрифужную пробирку, добавляют 0,1 мл 0,1 н. КОН и оставляют стоять 30 мин., затем прибавляют 0,1 мл раствора 20% сульфосалициловой кислоты; отбирают 0,06 мл отцентрифугированной жидкости, помещают в пробирку, добавляют 0,6 мл фона и перемешивают (концентрация фона такая же, как и в предыдущем методе). Смесь переносят в специальный электролизер и полярографируют.
Некоторые ученые считают, что высота полярографической волны безбелкового фильтрата сыворотки крови зависит от наличия в нем высокомолекулярных белковых соединений, содержащих сульфгидрильные группы, растворимые в сульфосалициловой кислоте. Исследования безбелкового фильтрата сыворотки крови, проведенные у 3000 больных злокачественными и доброкачественными опухолями, острыми и хроническими воспалительными процессами, практически здоровых людей и пр., показали, что полярографический метод в сочетании с клиническим, рентгенологическим и другими методами имеет диагностическое значение.
У больных со злокачественными опухолями, почти во всех случаях (99,7%), высота полярографической волны безбелковогофильтрата сыворотки крови выше соответствующей волны здоровых людей. После появления признаков некроза в опухоли высота полярографической волны несколько падает, однако остается значительно выше полярографической волны безбелкового фильтрата сыворотки крови здорового организма.
У больных с острыми и хроническими воспалительными процессами, а также с доброкачественными опухолями в состоянии роста примерно в 25% наблюдаются такой же высоты полярографические волны, как и при раке. Наибольшее количество расхождений между клиническим диагнозом и данными полярографического исследования наблюдается при легочной патологии.
Сравнительно большой процент ошибочных данных, полученных при исследовании больных с воспалительными процессами и доброкачественными опухолями, отнюдь не умаляет значения полярографического метода, а должен насторожить врача на более тщательное выявление заболевания. На основании данных большого количества исследований, проведенных М. Фортом, К. Брдичкой и др. авторами, установлено, что улучшение и ухудшение состояния больного во всех случаях отражается на высоте полярографической волны. Поэтому и по изменению ее интенсивности можно следить за течением болезни. Повышение полярографической волны должно сигнализировать о появлении рецидивов и метастазов.
Для дифференциальной диагностики малигнизирующейся и доброкачественной язвы необходимо динамическое наблюдение за течением процесса на протяжении двух-трех недель с систематическим исследованием полярографической кривой. При доброкачественных язвах в ходе лечения полярографическая кривая постепенно уменьшается и при выздоровлении становится нормальной. Если же и при правильном лечении кривая не падает, то возникает подозрение на малигнизирующнйся характер язвы, и больной должен быть послан на операцию.
Полярографический метод имеет значение при решении вопроса о радикальности произведенной операции для раннего выявления рецидивов и метастазов злокачественных опухолей. Если операция произведена радикально, то полярограмма к моменту снятия швов снижается до нормы, при нерадикальных же операциях этого не наблюдается.
При эффективном лучевом лечении онкологических больных полярографическая кривая к концу лечения также снижается до нормы. В тех случаях, когда лечение остается безуспешным, высота кривой не уменьшается.
Известно, что меланомы диагностировать существующими методами очень трудно. Такие заболевания, как нейрофиброматоз с сидерозом, гистиоцитомы с сидерозом, ксантомы, дерматоз Боуена, различные ангиомы и, наконец, папилломы с гиперпигментацией без гистологического исследования почти невозможно отличить от злокачественных меланом. Если учесть, что обычная эксцизионная биопсия при злокачественных меланомах ведет к усилению метастазирования и нередко даже к диссеминации опухолевого процесса, то применение полярографического исследования для дифференциальной диагностики весьма актуально и практически необходимо.
Полярографические данные характерны и постоянны для злокачественных меланом. При эффективном лучевом лечении меланом наблюдается закономерное снижение высоты полярографических кривых по мере злечения указанных опухолей. Например, больпой Т., 50 лет, клинический диагноз: подозрение на меланосаркому кожи.
15.6 полярограмма крови 67 мм.
20.6 пптогистологическое исследование после элекротэксцизии дало указание на меланокарципому.
18.7 после принятого полного курса лучевого лечения (12000 r) полярограмма крови снизилась до 51 мм.
Замечания о возможных ошибках при полярографических исследованиях
Как уже отмечалось ранее, полярографический метод является весьма чувствительным методом анализа химических веществ. Однако, пользуясь этим методом, иногда можно получить неправильные результаты. Особенно часто погрешности в результатах могут быть при исследовании крови и тканей, так как они, особенно при повышенной температуре, а также с течением времени, легко изменяются в своем составе. Поэтому для полярографического исследования лучше всего брать свежую кровь или же кровь, которая хранилась не больше одного часа. Кровь, хранившаяся в течение нескольких часов, обычно дает неправильные результаты.
Необходимо стремиться к тому, чтобы все исследования проводились в строго одинаковых условиях: для этого кровь у больных необходимо брать утром натощак. На точность полярографических показаний могут влиять и другие факторы. Прежде всего необходимо, чтобы человек, занимающийся полярографией, понимал сущность полярографического метода и умел во время заметить и устранить все неполадки, которые могут влиять на нормальную работу полярографической установки.
На правильность результатов может оказать влияние загрязнение ртути. Если ртуть, применяемая для капельного электрода, не была предварительно достаточно хорошо очищена или же загрязнилась веществами, содержащимися в резиновой трубке, то может произойти полная или частичная закупорка капилляра. При частичной закупорке капилляра изменяется частота капания ртути, которая, как уже говорилось ранее, существенным образом влияет на результаты исследования.
Для того, чтобы можно было судить о частичной закупорке капилляра, время от времени (не реже одного раза в 15 дней) необходимо проверять высоту полярографической волны безбелкового фильтрата сыворотки крови, взятой у заведомо здорового человека. Если окажется, что она изменилась по сравнению с той высотой полярографической кривой, которая должна быть у здорового человека, то необходимо еще раз проверить высоту полярографической волны по крови другого здорового человека и в случае необходимости заменить капилляр и очистить ртуть.
На высоту полярографической кривой, а следовательно и на результаты исследования, помимо других факторов, оказывает влияние напряжение. Перед началом каждого исследования необходимо проверить, чтобы стрелка вольтметра при полном напряжении показывала 4 вольта, т. е. находилась на красной черте. Точность результатов исследования зависит также от состояния полярографической установки. Если она исправна, точно установлена и отрегулирована, то получаемые результаты будут правильными. Для защиты от загрязнения полярограф после работы нужно покрывать чехлом.
ПРИЧИНЫ И СИМПТОМЫ
