Диагностика злокачественных опухолей, при которой распознавание процесса производится по морфологическим признакам отдельных клеток и групп их, носит название цитологической. Объектами исследования при цитологической диагностике являются: выделения человеческого организма, отслоения элементов опухолей различных органов и материал опухолей, полученный путем соскабливания, отпечатка, аспирации или пункции.
Первые попытки диагностики злокачественных новообразований через выделения относятся ко второй половине XIX века. А. Любимов в 1870 г. указал на возможность диагностировать рак легкого на основании характерных элементов, обнаруженных в мокроте. В 1882 г. Эрлих, использовав при изучении плеврального экссудата предложенный им метод окраски крови, цитологически установил рак легкого. П. Г. Гампельн (1887) подтвердил мнение Любимова о диагностической ценности элементов новообразования, обнаруженных в мокроте, и впервые детально описал морфологические признаки «раковых» клеток. Г. Н. Габричевский (1891) применил для окраски мазков мокроты способ Хенцинского, более простой, чем окраска по Эрлиху.
С тех пор накопилась обширная литература по вопросу цитологической диагностики злокачественных новообразований при исследовании клипико-лабораторных объектов. Однако эти исследования носили случайный характер, не было единого подхода к объекту, результаты трактовались различно, и возможность цитологической диагностики злокачественного роста на основании морфологических признаков не получила общего признания.
Благодаря новым достижениям в области теоретической онкологии, а также новым проверкам и углублению данных, полученных в прежнее время, цитологическая диагностика злокачественных новообразований вышла в последние годы на путь широкого развития. При этом установлено, что начальным изменением в развитии злокачественного роста является атипия клеток. Она предшествует деструктивному росту, который является более поздним признаком (П. Л. Познанин, А. Бабес, В. Шиллер).
Изучение экспериментального рака (Т. Дельман) позволило выделить стадию, предшествующую инвазии, и изучить структурные ее особенности; клетка еще до деструктивного роста приобретает свойства злокачественности, по которым можно ее распознать. Прединвазивные формы рака, характеризующиеся атанией клеток без нарушения физиологических границ, установлены для рака матки (интраэпителиальные раки), рака молочной железы, желудка, прямой кишки (интракапикулярные формы).
В патологических условиях, как и в нормальных, постоянно происходит десквамация клеток. Деквамируются не только отдельные клетки, но и группы их. Отторжение элементов опухоли происходит на разных стадиях злокачественного процесса. В выделениях еще до распада опухоли имеется полноценный для диагностики материал. Таким образом, представляется возможность при исследовании выделений диагностировать злокачественный процесс, что особенно ценно в ранних фазах его развития.
Морфологические особенности клеток злокачественных новообразований, изученные в срезах, могут быть выявлены в группах и отдельных клетках, встречающихся в выделениях. Раковые клетки, хотя и изолированные, сохраняют отличительные черты, дающие возможность установить их принадлежность к злокачественному новообразованию. Признание, что многочисленные биохимические и физиологические особенности злокачественных клеток должны иметь определенное выражение в морфологии (связь функции и структуры) привело к разработке морфологической характеристики раковой клетки.
Обширная литература по изучению морфологии клеток злокачественных опухолей говорит о том, что ни один признак, взятый в отдельности, не является специфическим для раковой клетки. Любой цитологический признак может встречаться не только в опухолевой клетке, но и при самых различных патологических процессах. Только совокупность признаков определяет морфологическую характеристику раковой клетки.
Комплекс характерных цитологических признаков, выявленных в группах клеток, а также отдельных клетках, — основа диагноза злокачественного процесса при цитологическом исследовании. Для практических целей нужно было выделить наиболее постоянные, легко учитываемые признаки, которые обеспечили бы достоверность цитологической диагностики злокачественной клетки.
Среди цитологических признаков, характеризующих природу злокачественной клетки, на нервом месте стоят кариологические изменения, которые являются наиболее ранними проявлениями малигнизации. Ядра злокачественных клеток в общем больше, чем ядра соответственных нормальных клеток, они отличаются крайним разнообразием форм, хотя основная масса их имеет круглую или овальную форму. Встречаются гигантские клетки с дольчатыми или лопастными ядрами. Количество хроматина большей частью увеличено, хотя наблюдаются и гипохроматические ядра. Хроматин глыбчатый или зернистый, неравномерно распределен в ядре при различном размере отдельных глыбок и зерен. Отмечается увеличение ядра сравнительно с размерами протоплазмы: цитоплазма нередко редуцирована до едва заметного тоненького ободка вокруг ядра.
Особое значение придается увеличению ядрышка, которое, по мнению некоторых авторов (Квенсель), является одним из основных признаков, характеризующих злокачественную клетку. Укрупненные ядрышки (достигающие величины 9 m и больше) обнаруживают большую изменчивость формы и могут быть множественными. Подчас встречается 2—4—6 и больше ядрышек. Форма их то округлая, то вытянутая, нередко неправильных очертаний. Часть ядрышек окрашивается основными, другая — кислыми красками. Протоплазма клеток большей частью базофильна, мелкоячеистой структуры, содержит различной величины вакуоли. Форма и величина клеток резко варьируют.
Нередко встречаются гигантские клетки с многими ядрами. Особенно характерны для злокачественного процесса симпластические образования с большим количеством ядер. Совокупность указанных цитологических признаков характеризует атипию злокачественной клетки, которая и является цитологическим критерием злокачественности. Однако не всегда указанные признаки бывают четкими, выраженными в достаточной мере, в чем и заключается основная трудность диагностики. Очень трудны для цитологического распознавания:
1) железистые формы раков, где атипия клеточных форм слабо выражена, и их трудно отличить от гиперплазии желез;
2) незрелые формы раков, близкие по морфологии к элементам регенерирующей ткани;
3) зрелые шиповидноклеточные раки со слабо выраженной атипией эпителия.
Диагностика этих форм требует уточнения. Выработка критерия злокачественности так же, как и при гистологический диагностике, должна производиться путем сравнения опухолевых клеток с нормальными не только в их статике, но и с учетом всей динамики превращения неопухолевых элементов в патологических и экспериментальных условиях. Опухоль развивается ня почве предшествующих патологических процессов, между ними имеется интимная связь.
При изучении новой области — патологической цитологии — надо исходить из тех особенностей, которые присущи элементам злокачественных опухолей различной локализации. Для этого надо точно представлять нормальный клеточный состав органов, где развивается опухолевый процесс, а также цитологию тех патологических процессов, которые предшествуют возникновению злокачественного роста.
Необходимость изучения не только клеток опухоли, но и других элементов, характеризующих повообразовательный процесс в целом, в настоящее время общепризнана. Этому исследователи придают очень большое значение (Квенсель, А. Я. Альтгаузен, А. В. Руденко). Метод комплексного цитологического анализа (С. Н. Никитин) построен на учете, при диагностике рака, состояния лейкоцитов, тканевых элементов и характера микрофлоры по цитограммам, разработанным для раков различной локализации (полости рта, шейки матки).
Надо подчеркнуть, однако, что решающее значение для диагноза имеет, конечно, наличие элементов опухоли. Тонкий диагноз опухоли зависит от умения находить и оценивать структурные особенности групп опухолевых клеток. Гистологи-онкологи и стали на путь детального изучения клеточных структур с применением дифференциальных окрасок, а также методов гистохимии, вскрывающих суть внутриклеточного обмена. Методы эти еще не нашли своего отражения в цитологической диагностике. Если трудна даже обычная микроскопическая диагностика биопсировацного материала, где можно учесть процессы деструктивного роста и реакции организма, то значительно сложнее цитологические изыскания, при которых приходится манипулировать с группами клеток и изолированными элементами, подозрительными в отношении злокачественности. Принцип всестороннего изучения материала, принятый в гистологии, должен быть распространен и на область цитологической диагностики.
Отсюда вытекают и требования, предъявляемые к методике исследования, главной задачей которой является облегчить распознавание природы исследуемых клеток. Методика получения и обработка материала имеет огромное значение для конечных результатов исследования. Применяются различные способы получения материала: пункция, аспирация, препараты-отпечатки, соскабливание шпателем, платиновой иглой, взятие тампоном. Техника взятия материала постоянно обогащается все новыми и новыми предложениями. О преимуществах методов при различных локализациях опухолей будет указано в специальных разделах. Необходимо только подчеркнуть, что более ценные те способы, которые дают возможность брать материал в месте поражения.
Что касается методов обработки материала, то существует три основных способа: макромикроскопический метод исследования нативных препаратов (неокрашенных), метод окрашенных мазков (так называемый цитологический) и метод гистологических срезов. Метод нативных препаратов широко применяется на протяжении ряда лет харьковскими исследователями (С. Л. Эрлих, А. Я. Альтгаузен и сотрудники) при изучении секретов и экскретов. Этим исследователям принадлежит заслуга разработки и широкого внедрения данного метода в медицинскую практику.
Микроскопическому исследованию предшествует макроскопическое изучение всего материала: послойное исследование жидких объектов и тщательное изучение густых с целью отбора тканевых частиц опухоли, «отторгающихся при наличии злокачественного новообразования под влиянием различных процессов, протекающих в нем (кровоизлияния, изъязвления, некробиоз, автолиз, механические воздействия), а также благодаря реактивным процессам в окружающих тканях» (А. Я. Альтгаузен). Из отборных кусочков путем расщепления и растягивания на предметном стекле приготовляются тонкие препараты, которые исследуют в нативном виде. Решающим моментом в диагнозе злокачественного процесса является наличие обрывков ткани, что наряду с морфологическими особенностями дает возможность установить опухолевую природу процесса.
Метод подкупает своей простотой; макроскопический отбор материала, несомненно, повышает эффективность диагностики. Однако изучение неокрашенных препаратов не дает возможности учесть структурные особенности клетки, что затрудняет цитологическую трактовку и делает менее достоверной диагностику. Диагностика случаев, когда попадают кусочки опухоли со стромой и распадом, является не ранней, а говорит уже о вполне развитых формах рака. Метод труден для усвоения учащимися, кроме того, невозможность консервации препаратов не позволяет изучить процесс в динамике.
Трудность трактовки цитологических картин и вытекающая отсюда необходимость уточнить диагностику способствовали широкому развитию метода окрашенных мазков. Приготовлению последних должны предшествовать макроскопический осмотр и отбор материала, из которого размазыванием по стеклу готовят тонкие мазки. Предложены различные методы-обработки (фиксации и окраски) мазков. Большей частью для фиксации применяют смесь Никифорова (спирт с эфиром в равных количествах), в которую погружают еще свежий мазок. Фиксация свежего, еще не высохшего мазка наилучшим образом обеспечивает сохранение формы клеточных элементов. В настоящее время наиболее широко применяют окрашивание по методу Романовского (в разных вариантах, употребляемых в гематологии) гематоксилин-эозином и по методу Папаниколау.
Метод Папаниколау (в модификации А. В. Руденко)
Накануне готовят растворы красок:
1) лихтгрюн 0,1 г. сухого вещества на 1 мл дистиллированной воды;
2) эозин желтоватый 0,1 г. сухого вещества на 1 мл дистиллированной воды;
3) бисмаркбраун 0,1 г. сухого вещества на 1 мл дистиллированной воды.
Водные растворы держат сутки при температуре 30—37 С. Из водных растворов приготовляют спиртовые растворы:
К смеси прибавляют фосфорномолибденовую кислоту в количестве 0,68 г сухого вещества и 4 капель насыщенного водного раствора углекислого лития.
Приготовление раствора оранж Г
На 100 мл 95% спирта берут 0,5 г. оранж Г и добавляют 0,015 г. фосфорно-молибденовой кислоты.
Порядок краски
1. Фиксатор — смесь Никифорова. Минимальное время фиксации — 30 мин.
2. Вынув из фиксатора, промыть спиртом 96°, затем дистиллированной водой,
3. Красят гематоксилином 2—3 мин., промывают в воде (первый стакан).
4. Дифференцируют 0,5% раствором соляной кислоты до покраснения 2—3 мин., сливают, промывают в воде (второй стькан). Контролируют под микроскопом окраску ядер.
5. Опускают на 1 мин. в слабый раствор углекислого лития (3 капли насыщенного водного раствора лития на 100 мл дистиллированной воды). Промывают в воде (третий стакан).
6. Тщательно обезводить мазок спиртом 96°.
7. Красят оранжем Г 1 мин., наливая краску на стекло. Слить и хорошо промыть спиртом до удаления избытка краски.
8. Красят лихтгрюном 2 мин., смыть спиртом, промокнуть.
9. Ксилол, бальзам. Покровное стекло (пленка).
Ввиду того, что краска лихтгрюна является дефицитной, была сделана попытка (Л. К. Куница) заменить ее другой, более доступной — брвллиантгрюн. В связи с этим была изменена как методика приготовления краски, так и порядок окрашивания мазков, предложенный Папаниколау.
Метод Папаниколау (в модификации Л. К. Куницы)
1. Краска оранж Г.:
1) оранж. Г — 0,5 г. краски на 100 мл спирта 96°;
2) фосфорномолибденовая кислота — 0,015 г;
Оставить на сутки. Полученный насыщенный раствор годен для окраски. Для приготовления промежуточной краски и бриллиантовой зелени нужно накануне приготовить водные растворы следующих красок:
1) бисмаркбраун — 0,1 г краски на 1 мл дистиллированной воды;
2) эозин (желтоватый или обычный) — 0,1 г. краски на 1 мл дистиллированной воды;
3) бриллиантовая зелень — 0,05 г краски на 1 мл дистиллированной воды +1 мл спирта 96°.
Приготовленные растворы плотно закрыть и оставить на сутки, лучше в термостате при температуре 37°. На следующий день готовят спиртовые растворы красок.
II. Промежуточная краска:
1) бисмаркбраун — 1 мл водного раствора на 200 мл спирта 96°.
2) эозин желтоватый — 1 мл водного раствора па 200 мл спирта 96° (если эозин обычный, то 1 мл водного раствора на 260 мл спирта 96°).
Для получения промежуточной краски, представляющей собой смесь, берут следующие количества веществ для 100 мл смеси:
Краски фильтруют перед смешиванием, остаток хранят непрофильтрованным.
III. Бриллиантовая зелень:
Бриллиантовая зелень 0,5 мл водно-спиртового раствора на 180 мл спирта 96°, после чего краска готова.
При окраске мазков, бриллиантгрюн, начиная от п. 8, техника будет следующей:
Предложенная Папаниколау краска дает хорошие результаты при исследовании выделений из различных органов, четкое и вместе с тем тонкое окрашивание клеточных элементов с выявлением деталей структуры ядер, очень красочно оттеняет базофилию и оксифилию протоплазмы. Присутствие крови в объектах, затрудняющее исследование в нативном виде, не препятствует получению четких картин при применении краски Папаниколау, так как кровь слабо окрашивается.
Необходимо подчеркнуть, что в окрашенных мазках прекрасно выявляются мелкие частички ткани, конгломераты и пласты клеток. Что же касается объемистых кусочков, то их, конечно, целесообразно исследовать по принятому в гистологии методу.
Метод ронгалитвейс красочной реакции, рекомендованный Роскиным для дифференциальной диагностики злокачественных клеток, состоит в обработке нефиксированных мазков лейкобазой метиленблау (ронгалитвейс). Ядра опухолевых элементов остаются при этом бесцветными (протоплазма слегка красится в голубой цвет), в то время как ядра клеток нормальных тканей окрашиваются в интенсивно синий цвет.
Е. А. Воинов подверг проверке метод ронгалитвейс на мазках из опухолей и из плевральных экссудатов и получил положительные результаты. По мнению автора, метод заслуживает внимания. Суправитальный метод окраски, предложенный Квенселем для исследований жидкостей из серозных полостей, состоит в том, что каплю осадка центрифугата жидкости наносят пипеткой на стекло, смешивают с каплей краски, состоящей из равных частей метилленблау, кадмия и суданкадмия, и накрывают покровным стеклом. Окрашивание особенно эффективно выявляет структуру ядрышек, на измерении которых построена дифференциальная диагностика злокачественных клеток, трудно отличимых от клеток эндотелия серозных полостей. Размер ядрышка опухолевых клеток достигает 6—9 m, эндотелия — 1—3 m. Дифференциальным отличием является также быстрота окрашивания: раковые клетки окрашиваются в течение 2—3 мин., эндотелиальные — через 10 мин.
Цадик, положительно оценивающий метод Квенселя, указывает, что возможно, быстрота окрашивания представляет специфическое свойство раковой клетки. Суправитальный метод окрашивания нейтральрот-янусогрюн (рецепт краски: а) 0,2% раствор нейтральрот в 96° спирте, б) такой же раствор янусгрюн. Смешивают перед приготовлением стекол; три части первого раствора в одну часть второго. Идеально чистые предметные стекла нагревают и покрывают тонким слоем красящей смеси, размазывая наподобие кровяного мазка краем шлифованного стекла), но мнению Г. Е. Земана, позволяет изучить цитофизиологические особенности, недоступные для наблюдения в фиксированных препаратах.
Метод четко выявляет хондриосомы (янусгрюн) и зернистые включения (нейтральрот); последние в большом количестве обнаруживаются в злокачественных клетках.
Н. Л. Кассирский считает, что для полноценного цитологического исследования необходимо комбинировать фиксационные и витальные методы окраски.
Гистологический метод, применяемый для обнаружения элементов новообразования в выделениях, состоит в том, что материал фиксируют (формалин, формалин-спирт, формалин-ацетон, жидкость Карнуа), заливают в целлоидин или парафин, приготавливают срезы и окрашивают их обычно применяемыми в гистологической технике красками. Жидкие объекты (моча, серозные жидкости) предварительно обрабатывают алкоголем, осажденный белок увлекает клеточные элементы. Осадок обрабатывается обычным способом.
В настоящее время нет общепринятого взгляда на ценность метода срезов при исследовании клинико-лабораторных объектов. Часть исследователей (Ф. А. Истомина) считает его весьма эффективным, указывая на следующие преимущества: 1) минимум повреждения клеток, 2) клетки не отделены друг от друга, как в мазках, 3) можно видеть слои клеток без нарушения их архитектурных отношений, 4) материал концентрируется для исследования. Последнее обстоятельство имеет особо важное значение, так как позволяет исследовать значительно большее количество материала, чем при других методах.
По мнению других авторов (А. Я. Альтгаузен), этот метод наиболее эффективен при наличии в материале крупных частиц ткани. Группы и отдельные клетки лучше выявляются в мазках. К недостаткам метода относится сложность обработки, необходимость специального оборудования.
Цитологическая диагностика опухолей представляет ценный по своей эффективности метод клинико-лабораторной диагностики, завоевавшей прочное место в практике онкологических учреждений. В настоящее время гистологическое исследование не может быть единым оружием в руках морфолога, оно должно быть дополнено исследованием цитологическим. Однако цитологический метод диагностики никоим образом не может и не должен подменять гистологический, который является критерием для оценки цитологических картин: эти два метода дополняют друг друга.
Ввиду трудности правильной оценки цитологических картин, необходима специальная подготовка в данной области. Дальнейшее развитие цитологической диагностики должно идти в направлении разработки техники (получения возможно более полноценного материала) и уточнения цитологии различных форм опухолей; последнее связано с широким применением методов гистологического и цитофизиологического анализа.
ПРИЧИНЫ И СИМПТОМЫ
