ПРИЧИНЫ И СИМПТОМЫ    ОНКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ    ПРЕДРАК    ДИАГНОСТИКА    МЕТОДЫ ЛЕЧЕНИЯ    РЕАБИЛИТАЦИЯ    ЛЕКАРСТВА    НОВОСТИ ОНКОЛОГИИ
А Б В Г Д Е Ж З И К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я
Где лечить рак:   Россия Израиль Германия США Швейцария Корея Венгрия Польша Беларусь Франция Испания Италия Китай Чехия Канада Турция Финляндия Япония Австрия Бразилия Сингапур Латвия Литва Великобритания
Употребляя в пищу определенные продукты, можно уменьшить риск появления онкозаболеваний. Какие же продукты способны предотвратить рак?   Узнать >>
Какие анализы необходимо сдавать, чтобы диагностировать рак на начальной стадии, увеличив тем самым шансы на успешное лечение?   Узнать >>
Как влияет химиотерапия на организм онкологического больного? Насколько могут быть тяжелыми побочные эффекты?   Узнать >>
Каковы первые признаки рака? На что обратить внимание? Как не упустить начало онкологического заболевания?   Узнать >>

Лечение рака >> Книги по онкологии >>

Метод тканевых культур на целлофане и возможности его применения в патогистологической лаборатории при диагностике рака


«Новые методы диагностики в онкологии и рентгенологии»
Под редакцией И. Т. Шевченко.
Гос. мед. изд-во УССР, Киев, 1957 г.
OCR Wincancer.Ru
Приведено с некоторыми сокращениями

Метод тканевых культур имеет большое значение при решении различных вопросов биологии и медицины. К важнейшим достижениям, полученным при использовании этого метода, относятся, данные о биологических особенностях, морфологической структуре, гистогенезе злокачественных опухолей. Знание природы злокачественных новообразований является одним из существенных звеньев диагностики рака. Особенности роста новообразования, степень его Злокачественности определяют собой характер течения болезни, выбор метода лечения, прогноз.

Попытки применить метод культур тканей с целью диагностики злокачественных опухолей предпринимались уже давно. Описаны случаи удачного использования этого метода при диагностике злокачественной меланомы, причем правильный диагноз заболевания удалось поставить на основании характерного роста в культурах тканевых элементов беспигментной опухоли с быстрым образованием пигмента.

Однако широкому распространению метода тканевых культур в лабораторной практике препятствовала сравнительная сложность самого метода, трудности, связанные с получением и храпением плазмы; опасность инфицирования культур требовала создания специальных лабораторий, состоящих из двух-трех комнат, с предоперационной, операционной и т. д.

К тому же в советской литературе нет более или менее подробно описанной методики культур тканей. Книга А. А. Кронтовского и Л. И. Полева, изданная еще на заре разработки метода тканевых культур, а 1916 г., давно уже стала библиографической редкостью. Кроме того, сама методика культур тканей с тех пор шагнула далеко вперед. В настоящей работе ставится задача предложить такой хорошо апробированный метод культивирования тканей вне организма, на целлофане, осуществление которого оказалось бы возможным в любой лаборатории периферического лечебного учреждения, онкодиспансера и др. В работе приводятся сведения о том, как врач без больших материальных затрат, без употребления плазмы сможет использовать этот метод в своей повседневной практике. В связи с этим приводится только самый необходимый минимум оборудования, инструментария, стекла и реактивов, достаточных для постановки тканевых культурно описываемой методике.

В первой фазе своею внедрения в практику лабораторий методика культур тканей окажет большую услугу как вспомогательный метод при исследовании биоптического материала (лимфатических желез, кусочков опухолевой ткани и др.), особенно в тех случаях, когда не представляется возможным сделать серийные срезы или патогистологическое исследование затруднено ввиду недостаточного количества материала. Если при посадке, например, лимфатической железы уже на второй-третий день можно получить рост раковых клеток, то уже это одно обстоятельство должно привлечь внимание онкологов. Метод тканевых культур явится хорошей школой для молодых работников патогистологических лабораторий, так как, наблюдая различные превращения опухолевых клеток, кровяных элементов, можно составить представление о том многообразии тканевых форм, которое имеет место в патогистологической практике.

Это также имеет значение и в связи с развитием и все более широким внедрением в практику цитологического метода исследования. Картины, наблюдаемые в культурах тканей, в отдельных своих звеньях нередко аналогичны морфологическим структурам при цитодиагностике рака. При посадке ткани сразу же после биопсии (операции) имеется возможность цитологического исследования кусочка ткани.

Цитологу иногда затруднительно на основании мазка сделать заключение о диагнозе. Естественно, что при наблюдении в динамике за живой клеткой в течение более или менее длительного времени, в полузатемнешюм поле зрения, или же при использовании фазо-контрастной установки с последующей фиксацией и окраской препарата, диагностические возможности будут расширены.

Культивирование осадка асцитической и плевральной жидкости будет иметь значение для выяснения сравнительно трудно определяемого генеза асцита или плеврита, особенно при необходимости исключить раковое заболевание. Для дифференциальной диагностики применение бактериологических методов окраски явится целесообразным, так как питательная среда тканевых культур благоприятна для размножения различных микроорганизмов. Явления дифференцировки (созревания) опухолевых тканей, имеющие место при культивировании тканей без пассажа, при исключении из питательной среды ростстимулирующих веществ, позволяют с достоверностью определить гистогенез злокачественных новообразований (А. Д. Тимофеевский). Этим же открываются перспективы для изыскания веществ, способствующих ускорению процессов дифференцировки ткани, с потерей способности к размножению.

Метод тканевых культур открывает широкие возможности для научно-исследовательской работы: изучение механизма влияния различных фармакологических и лекарственных средств, лучистой энергии, изучение морфологических изменений раковых клеток, в сравнительном аспекте с нормальными, биологические особенности, чувствительность клеток различных опухолей к тем или другим воздействиям и др.

В настоящей работе описывается методика тканевых культур, применяемая с большим успехом в течение многих лет А. Д. Тимофеевским, а также другими выдающимися исследователями (Н. Г. Хлопиным, А. А. Кронтовским, А. Каррелем, А. Фишером, В. Эрлом и др.). Кроме того, в работе приводится новая методика постановки культур в насечках целлофана, разработанная Л. Ф. Арендаревским в лаборатории А. Д. Тимофеевского, которая является дальнейшим развитием метода эксплантации, так как имеет известные преимущества перед существующими методиками культивирования, позволяя получить рост чистых культур нормального и раковоизмененного эпителия на целлофане, в жидкой среде (без плазмы). Вся методика делится на два больших раздела — приготовление питательной среды и постановка тканевых культур.

Метод культур тканей

Для постановки тканевых культур необходимо иметь:

I. Рабочее место. Идеальным является отдельная изолированная комната с настольным стеклянным боксом (можно и без бокса). В других случаях (при отсутствий отдельной комнаты) настольный бокс тщательно протирается хлорамином или другим бактерицидным веществом или же облучается кварцевой или бактерицидной лампой.

Значительно облегчает работу разработанный Е. А. Тимофеевской метод с применением антибиотиков для обезвреживания питательной среды культур при развитии в ней микроорганизмов или же при культивировании обычно инфицированного материала (слизистые оболочки, наружные кожные покровы). 100—200 ед. стрептомицина или пенициллина, или комбинация этих веществ на 1—2 см3 питательной среды в чашке Карреля приводит к подавлению роста микроорганизмов, не оказывая заметного влияния на рост тканей. Опасность загрязнения может представлять только плесень, нередко встречающаяся на слизистых оболочках желудочно-кишечного тракта или же попадающая извне. Промывание в таких случаях тканевого материала в стерильном физиологическом растворе, очистка воздуха помещения от пыли позволяет избежать загрязнения тканевых культур плесенью.

II. Оборудование: 1) термостат на 37°С; 2) центрифуга для получения плазмы, сыворотки, эмбрионального экстракта. Для получения плазмы она необходима. Очистки сыворотки и эмбрионального экстракта от взвешенных частиц можно добиться отстаиванием; 3) холодильник для хранения плазмы и других скоропортящихся питательных веществ. Для этой же цели можно воспользоваться обыкновенным термосом с периодическим вкладыванием в него кусочков льда. Сыворотку и физиологические растворы можно хранить и при комнатной температуре, лучше в прохладном месте. Эмбриональный экстракт при этой температуре не портится, но быстрее теряет свою активность; 4) микроскоп.

Из инструментария для постановки культур необходимы; копье, пинцет зубной или же глазной изогнутый, пинцет анатомический, ножичек, ножницы. Кроме того, для взятия крови нужны зажимы Пеана, сосудистый зажим (можно воспользоваться зажимом Пеана с надетыми резинками на концы бранш), глазные тонкие ножницы для насечки артерии, хирургические иглы, шелк. Приготовление культур производится лезвием от безопасной бритвы.

Из стеклянной посуды нужны чашки Карреля (легко изготовить в любой стеклодувной мастерской, желательно из нейтрального стекла), предметные стекла (желательно с луночками). Предметные стекла можно заменить часовыми стеклышками и даже солянками. Нужны также чашки Петри, пастеровские пипетки, канюли для взятия крови у животных, центрифужные пробирки.

Стерилизация рингеровского раствора производится или в автоклаве, или же текучим паром в аппарате Коха, или же кипячением, лучше повторным и на водяной бане. Раствор Тироде обязательно стерилизовать в виде двух вышеуказанных порций, которые после стерилизации и остывания растворов сливаются в одну колбу, в которую также добавляется имеющийся в ампулах 40% раствор глюкозы из расчета 1,0 г на 1 литр (2,5 см3). Для культивирования тканей животных можно пользоваться раствором Рингера с добавлением на литр раствора 1,0 г глюкозы.

Для культивирования человеческих тканей А. Тимофеевский рекомендует продувать раствор Тироде газовой смесью 5—10% углекислоты в воздухе. Для этого в кислородную подушку, имеющую примерно сбъем 25 литров, вдувается один-два литра углекислоты, а затем воздух до предела. На наконечник подушки надевается резиновая трубочка, которая соединяется пастеровской пипеткой. Продувать можно сразу весь раствор Тироде или же каждый флакон в отдельности. Учитывая, что в выдыхаемом воздухе содержится большой процент углекислоты, флаксны можно продувать ртом через стерильную пастеровскую пипетку, закрытую ватной пробочкой. При этом рН среды устанавливается 7,3—7,4. Для контроля среды очень удобно пользоваться индикатором фенолротом, который при рН 6,8 имеет желтую окраску, а свыше 7,3 все усиливающуюся розово-красную окраску. Фенолрот прибавляют в раствор Тироде перед стерилизацией, из расчета концентрации 1 : 200 000, которая не оказывает заметного влияния на рост культур.

Для разлива питательных сред пригодны различных размеров ампулы или же баночки из-под пенициллина, сделанные из нейтрального стекла. Резиновая пробочка заменяется ватой, сверху повязывается двойной бумажный колпачок.

III. Условия, которые необходимо соблюдать для поддержания жизни тканей вне организма, следующие: 1. Постоянная температура 36,5—37°С.

2. Кусочек ткани должен быть укреплен, иметь плотную основу, по которой могли бы расти клеточные элементы. Нежная сеточка фибриллей фибрина является хорошим субстратом для сетсвидного роста соединительнотканных (саркоматозных) клеток. С этой целью в жидкую плазму, разведенную наполовину жидкостьюТироде, помещают кусочек ткани, когда плазма свертывается, кусочен оказывается плотно укрепленным в сгустке плазмы. При культинировании эпителия на целлофане кусочки фиксируются в особых насечках целлофана.

3. Для роста тканей необходимы питательные и ростстимулирующие вещества. В качестве питательной среды лучше всего пользоваться сывороткой того же вида животного, ткани которого культивируются вне организма. Но обычно для тканей животных употребляют лошадиную сыворотку (иногда с примесью гомологической), а для тканей человека — человеческую. Сыворотка разводится наполовину жидкостью Тироде.

Для культивирования тканей животных, а в некоторых случаях и человека, можно использовать асцитическую жидкость больных с недостаточностью сердечно-сосудистой системы. Асцитическая жидкость раковых больных пригодна для культивирования опухолевых тканей животных, иногда человека. В последнем случае лучше пользоваться смесью асцитической жидкости и человеческой сыворотки.

Для стимуляции роста ткани употребляют эмбриональный экстракт. Лучше пользоваться эмбриональным экстрактом того же вида животного, ткани которого культивируются вне организма. Обычно пользуются куриным эмбриональным экстрактом. А. Д. Тимофеевский показал, что прекрасный рост опухолевых тканей человека удается получить при применении коровьего эмбрионального экстракта. Идеальным для раковых опухолей человека является употребление экстракта из эмбрионов человека (2—3 месяца), особенно когда имеет место преждевременный выкидыш с сохранением оболочек. Также могут быть пригодны стерильно полученные части эмбриона в случаях, когда производится искусственное прерывание беременности. Кроме ростстимулирующих веществ в эмбриональном экстракте содержится большое количество питательных (пластических) веществ.

4. Для получения длительного роста культур питательную среду нужно периодически (два-три раза в неделю) менять на новую, а также пересаживать (пассировать) ткань с разрезанием кусочка или без разрезания. Травмирование ткани при данной манипуляции является фактором, стимулирующим рост. Все мероприятия проводятся при строгом соблюдении условий асептики и антисептики.

IV. Основные принципы получения чистых культур различных тканей. При посадке ткани обычно наблюдается смешанный рост клеточных элементов. Наряду с фибробластами происходит рост клеток эпителия, миобластов, нейроглиальных элементов. Но исследователю очень часто необходимо получить так называемую чистую культуру, в зоне роста которой отмечаются только клетки одного типа — или соединительнотканные (саркоматозные), или же клетки эпителия (например, паренхима раковой опухоли без примеси соединительнотканной стромы).

Существует в основном два методических принципа получения чистых культур — анатомический (аналитический) и физиологический (элективный). Анатомический метод заключается в том, что исследователь по возможности вырезает однородную ткань. При культивировании эпителия слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта слизистая осторожно отслаивается от подслизистой оболочки. При приготовлении культур из раковой опухоли или же из метастаза в лимфатическую железу стремятся вырезывать участки, наиболее подозрительные по макроскопическому виду на клетки новообразования. Однако анатомический метод имеет узкое применение и большей частью является вспомогательным.

Физиологический, или элективный, метод основан на том принципе, что одни ткани при определенных условиях среды растуг хорошо, а при других хуже. Создавая условия, благоприятные для роста одной ткани и неблагоприятные для другой, можно получить чистую культуру.

Росту как нормальных, так и саркоматозных фибробластов, способствует наличие опорного аппарата — фибриллярной сеточки фибрина. Фибробласты сравнительно легко можно получить в виде чистых культур при посадке самых различных мезенхимальных структур организма, (рыхлая подкожная клетчатка, селезенка, костный мозг и т. п.). Излюбленным объектом для многих исследований при изучении влияния различных факторов служит сердце куриного эмбриона (семь-восемь дней инкубирования). После одного-двух пассажей отмечается исключительно мощный рост фибробластов. Росту фибробластов способствует наличие в питательной среде достаточного количества эмбрионального экстракта.

Получение чистых культур тканей сарком человека и животных также не представляет особых трудностей. Важное практическое значение имеет постановка культур из тканевых элементов нормальной и лейкемической крови. Впервые этот метод разработали П. Авроров и А. Д. Тимофеевский. Обычная среда благоприятна для роста незернистых форм лейкоцитов (лимфоцитов и моноцитов) и неблагоприятна для более высоко дифференцированных зернистых форм, а также эритроцитов, которые вскоре после посадки дегенерируют. Поэтому сравнительно легко можно получить чистые культуры незернистых форм лейкоцитов и наблюдать их превращения.

У человека кровь берут из мякоти большого пальца. Выступающая после укола кровь всасывается в пипетки, которые заполняются стерильной рингеровской жидкостью с расчетом разведения крови в пять-десять раз. После свертывания сгусток крови разрезается на маленькие кусочки, которые садят обычным способом.

Заслуживает внимания и второй метод получения крови для посадки, применяемый А. Д. Тимофеевским. При этом 10 см3 берут из локтевой вены с соблюдением всех манипуляций, применяемых при получении плазмы. После центрифугирования в центрифужной пробирке образуется три слоя — верхний слой плазма, средний — лейкоцитарная пленка, нижний — эритроциты. Плазму отсасывают так, чтобы не повредить лейкоцитарную пленку. В пробирку прибавляют одну-две капли эмбрионального экстракта. После свертывания крови лейкоцитарную пленку вынимают из пробирки пинцетом и разрезают в жидкости Рингера на кусочки 2—3 мм в диаметре.

Перед посадкой определяется формула крови. Культивируется ткань в плазме человека (разведенной пополам плазмой гуся или кролика) без эмбрионального экстракта. Жидкой фазой служит человеческая сыворотка, разведенная наполовину жидкостью Тироде. Культуры продуваются воздухом, содержащим 5—10% углекислоты. Для морфологического и сследования таких культур применяется способ приготовления сухих мазков. Культуру вместе с зоной роста вынимают из флакона, освобождают острым ножичком от фибрина и захватывают острием иглы. Острие иглы осторожно проводят по поверхности обезжиренного стекла. После подсыхания мазок фиксируется и красится азур-II-эозином. При этом можно получить прекрасные препараты.

Г. К. Хрущев подробно описывает различные способы получения культур крови, в том числе и чистых культур гранулоцитов, лимфоцитов и моноцитов. Для роста тканей эпителиального происхождения наиболее благоприятны условия поверхности сгустка плазмы, зоны фибробластов, стекла, слюдяной пластинки, целлофана. При посадке же эпителия в сгусток очень часто наблюдается разжижение плазмы с образованием на большом пространстве полости разжижения нередко с разрывом ткани, выпадением кусочка в жидкую фазу, с образованием по краю полости эпителиальных тяжей. В редких случаях по стеклу или слюде отмечается рост эпителиальных мембран.

Рост чистых культур эпителия можно сравнительно легко получить при культивирований тканей на целлофане с фиксацией кусочков в особых насечках целлофана. Овладению методом культивирования тканей раковых опухолей должно обязательно предшествовать освоение метода культивирования нормальных эпителиальных тканей, особенно зародышей и молодых животных.

Получение чистых культур мышечной ткани, особенно неэмбриональных животных, связано с очень большими трудностями, так как мышечные элементы слабо пролиферируют вне организма и их росту препятствует обычно наблюдаемый интенсивный рост фибробластов. Более склонны к росту вне организма опухоли мышечного происхождения — рабдомиобластомы.

Нервные клетки не размножаются вне организма. Сравнительно легко можно получить чистые культуры нейроглиальной ткани самых различных участков нервной системы. Уже вскоре после посадки в зоне роста наблюдаются только элементы глии. Сравнительно хорошо растут вне организма различные опухоли нейроглиального происхождения, подробно изученные А. Д. Тимофеевским.

Техника взятия крови

Кровь у животных берется тремя различными методами: 1) из сердца — или непосредственно через грудную стенку, или же после торакотомии и обнажения органа; 2) из вены насасыванием шприцем (у мелких животных) или посредством канюли (у крупных животных); 3) из артерий, обычно сонной или же под крыльцовой (птиц), реже — брюшной аорты. Донорами чаще всего служат куры, гуси, лошади, реже — кролики, морские свинки, мыши и крысы. Для культивирования человеческих тканей берут кровь человека (чаще всего IV группы).

Получение крови из сонной артерии курицы (гуся, кролика), обычно с целью взятия плазмы, проводится по одному принципу. Перед и после взятия крови внутримышечно или подкожно вводятся 20—50 см3 теплого изотонического раствора. За 24 часа до извлечений крови животных не кормят, в противном случае плазма получается мутной и жирной и в ней плохо растут культуры. Кровь молодых животных более пригодна, чем кровь старых. Лучшей считается плазма гуся или курицы, в которой могут расти ткани самых различных животных и человека. Кровь может браться один-два и больше (у птиц) раз.

Получение крови из сонной артерии. После обработки переднего отдела шеи и введения физиологического раствора животное укрепляют в операционном станке. При взятии крови принимают участие два-три человека. Операция проводится под местным обезболиванием. После укрытия животного стерильными салфетками с прорезом в области шеи обрабатывают операционное поле йодом и протирают спиртом. Острым скальпелем (или ножницами) на 3—6 см от яремной ямки посредине делают разрез в 4—5 см, рассекают кожу и фасции. Мышцы шеи разделяют друг от друга при помощи зонда.

Сонная артерия лежит в нервно-сосудистой капсуле у шейных позвонков. Под капсулу подводят зонд, который натягивает ее под прямым углом к сосудистому длиннику. После выделения нерва сонную артерию отпрепаровывают на протяжении 2,5—3 см, а стенку тщательно очищают от фасции. Под артерию подводят изогнутый глазной пинцет, который слегка натягивает ее, выводя из глубины на поверхность, а также подводят три лигатуры: первую — под дистальнуго часть сосуда, которую сразу же перевязывают, вторую —под проксимальную часть, которую завязывают после взятия крови, и третью — между двумя первыми, предназначенную для перевязки введенной в сосуд канюли. Затем на проксимальную часть сосуда накладывают сосудистый торсионный зажим. Вблизи от дистальной лигатуры артерию надсекают острыми тонкими ножничками. Просвет сосуда расширяют крючком (изогнутая, расплюснутая па конце проволока) и в образованное отверстие вводят на 1—1,5 см канюлю, которую плотно перевязывают.

Если имеют в виду получение сыворотки, под канюлю подводят обычные пробирки или стеклянные цилиндры. Для полного свертывания кровь ставят на 0,5—1 час в термостат, затем в прохладное место, где сыворотка отстаивается. Для получения плазмы под канюлю подводят охлажденные парафинированные центрифужные пробирки и снимают сосудистый зажим. Кровью наполняют 3/4 пробирки, сосуд зажимают пальцем, пробирку ставят в баночку со льдом, подводят следующую пробирку и т. д.

После взятия крови перевязывают проксимальную часть сосуда, снимают среднюю лигатуру и извлекают канюлю, причем сливают остаток крови. Рану зашивают, края смазывают йодом, внутримышечно вводят 30—50 см3 физиологического раствора. Пробирки с кровью ставят в центрифужные патроны, на дно которых некоторые рекомендуют класть немного льда, что не обязательно, и центрифугируют в течение 10—15 мин. Отцентрифугированную кровь вновь ставят в ванночку со льдом и переносят в комнату для разливки питательных сред (в бокс). При соблюдении условий асептики плазму отсасывают пипеткой емкостью в 25 см3. Важно не повредить лейкоцитарную пленку, ибо при попадании в плазму эритроцитов, она может, во-первых, гемолизироваться, а во-вторых, свернуться. Плазму разливают в охлажденные парафинированные пробирки, емкостью 3—4 см3, которые тотчас же ставят в ванночку со льдом и переносят в холодильник (термос).

Значительно упрощается получение плазмы при употреблении стабилизаторов крови, например, гепарина, синантрола и др. При этом совершенно не надо парафинировать посуду, получаемая плазма сохраняется в течение пяти-шести месяцев в жидком состоянии в холодильнике, не теряя способности к свертыванию при добавлении эмбрионального или тканевого экстракта. Употребляется гепарин в концентрации 1 : 20 000. Обычно на 15—20 см3 свеже взятой крови прибавляется 1 см3 0,1% раствора гепарина. Гепарин — термостабильное вещество, но лучше его стерилизовать на водяной бане (по 45 мин. в течение 3 дней) и прибавлять в стерильные центрифужные пробирки до взятия крови.

А. А. Кронтовский разработал методику получения оксалатной плазмы. В стерильные центрифужные пробирки наливают 1 см3 1 % раствора щавелево-кислого натрия из расчета на 10 см3 крови (на пробирке заранее делается отметка 10 см3). Полученная обычным методом кровь перемешивается со стабилизатором, центрифугируется, плазму отсасывают и разливают по ампулам. Так как щавелево-кислый натрий токсичен для тканевых культур, то для удаления ионов щавелевой кислоты используют хлористый кальций. С этой целью перед употреблением оксалатную плазму разводят модифицированным рингеровским раствором, с избытком ионов Са, следующего состава: NaCl — 8,13; СаСl2 — 1,08; КСl — 0,42; дестиллированная вода — 1000 см3. При этом избыток ионов кальция выпадает в виде осадка щавелево-кислого кальция, а образующийся по реакции NaCl компенсирует недостаток этой соли в модифицированном растворе.

После центрифугирования (1—2 мин.) получается совершенно прозрачная, разведенная в два раза, готовая к употреблению плазма. Недостатком этого метода является то, что не всегда можно быть уверенным в полном осаждении кислотного остатка щавелевой кислоты; возможно поэтому плазма иногда теряет способность к свертыванию.

Взятие крови из вен применяется обычно для получения сыворотки крови. У лошади кровь берется путем венепункции. Набухание вены достигается наложением жгута вокруг шеи или прижиманием вены в яремной ямке. Взятие крови (по А. С. Белинскому) производится в стеклянные цилиндры емкостью 1—3 литра. Цилиндры закрывают двумя пергаментными крышками таким образом, чтобы края нижней (подлежащей) крышки выступали из-под краев верхней. Сверху цилиндр обвязывают еще бумагой и стерилизуют. Кровь берется при помощи большой полой иглы, соединенной с резиновым шлангом, второй конец которого заканчивается стеклянной трубкой со срезанным концом. При взятии крови верхнюю пергаментную крышку отворачивают на половину ее поверхности, а нижнюю протыкают стеклянной трубкой для впуска крови.

Кровь поступает в цилиндр ровной струей, не обливая стенок сосуда, так как после свертывания крови в этих местах будет задерживаться сгусток, отделение которого сопровождается нежелательным гемолизом. После заполнения 3/4 цилиндра стеклянную трубку извлекают, цилиндр закрывают верхней крышкой, затем подставляют следующий цилиндр и т. д. Кровь помещают на 30—40 мин. в термостат, а затем хранят на холоду. Через 24—48 часов наступает полная ретракция сгустка с образованием верхнего прозрачного слоя сыворотки. В боксе сыворотку разливают по ампулам (баночкам).

Небольшие количества крови с целью получения человеческой сыворотки могут быть получены из локтевой вены путем насасывания шприцем. Большие количества могут быть получены на станции переливания крови, причем кровь берется у донора без стабилизатора крови.

Приготовления эмбриональных и тканевых экстрактов

Куриный эмбриональный экстракт готовится из восьми-девятидневных зародышей, инкубированных в термостате при 39—41°С (можно и при 37°С). После смазывания йодом яйцо у тупого конца тщательно вытирают спиртом, откалывают скорлупу, вскрывают воздушную камеру. Внутреннюю (белковую) кожицу осторожно отделяют и содержимое яйца выливают в чашку Петри. Зародыш освобождают от оболочек и перекладывают в другую чашку Петри с рингеровским раствором. После измельчения эмбриональную кашицу переносят в центрифужные пробирки, разводят наполовину рингеровским раствором и центрифугируют в течение 10—15 мин., затем разливают по ампулам. Активность экстракта сохраняется 7—10 дней.

Коровий эмбриональный экстракт готовится из двух-трехмесячных эмбрионов. Из бойни ампутированную матку доставляют в лабораторию вместе с зародышем. В большом тазу обмывают переднюю поверхность матки водой. Таз переносят в чистую комнату (бокс). Поверхность на месте предполагаемого разреза смачивают спиртом и зажигают, затем двукратно смазывают йодом. Стенку матки захватывают пинцетом, продольным разрезом рассекают маточную мускулатуру, осторожно разрезают децидуальную оболочку. Через отверстие пинцетом с длинными браншами извлекают зародыш, ножницами быстро перерезают пуповину. Эмбрион переносят в стерилизатор, в котором разрезают на несколько частей и пропускают через мясорубку. Измельченную массу собирают в стерильную стеклянную банку, разводят рингеровским раствором 1 : 1, 1 : 2 и ставят на 30—45 мин. в термостат, затем разливают пипеткой со срезанным концом в центрифужные пробирки, центрифугируют 10—15 мин. и разливают по ампулам. Активность экстракта сохраняется до 10 дней.

Тканевые экстракты (из селезенки, костного мозга) отличаются от эмбриональных тем, что активность их практически сохраняется много недель и даже месяцев. А. Кронтовский готовил тканевые экстракты так: до стерилизации в центрифужную пробирку насыпал небольшое количество (0,25 высоты) чистого толченого и просеянного через сито стекла. После стерилизации в пробирку ложил кусочки ткани, прибавлял равное количество рингеровского раствора. При помощи стерильного стеклянного пестика ткань тщательно растирал со стеклом, пробирку центрифугировал 1 — 2 мин., образовавшуюся над осадком прозрачную жидкость разливал по ампулам. Приготовление экстракта по этому способу занимает несколько минут и экстрагирование происходит достаточно полно.

Постановка тканевых культур

Подготовка. В настольном боксе располагают все необходимые для постановки культур инструменты, питательные среды, спиртовку, баночку со спиртом для прожигания инструментов, металлический штатив. На стекло ставят несколько стерильных чашек Петри. Стеклышки с луночками обжигают на спиртовке и кладут в чашки Петри. Пробирки для пипеток обжигают и ставят в штатив. После обжигания в них вставляют пастеровские пипетки.

Приготовление кусочков ткани для посадки. Взятие кусочка ткани у животных и человека производят обычными хирургическими методами с соблюдением условий асептики и антисептики. Крышку чашки Петри слегка приоткрывают и в луночку наливают несколько капель раствора Рингера. Вырезанный из организма кусочек ткани помещают на предметное стеклышко и разрезают на три-пять меньших кусочка. После обжигания и остуживания в левую руку берут копье, а в правую — бритву. Кусочек ткани извлекают из луночки на край предметного стекла и слегка прижимают к стеклу перпендикулярно расположенным копьем. Плавным и нежным ножнецевидным движением копья и бритвы ткань разразают на маленькие квадратики с ребром примерно 0,8—1,5 мм, толщиной 0,5 мм. Края кусочков должны быть гладкими, не рваными, кусочки примерно одинаковых размеров. В одной чашке желательно готовить не больше четырех-восьми кусочков ткани. Для посадки выбираются наиболее жизнеспособные кусочки. Приготовление культур должно происходить не позже, чем через 1—3 часа после взятия ткани у животного и 1—2 часа — у человека, так как это отражается на росте тканей.

1. Методика А. Максимова (метод «висячей капли»). Берут две чашки Петри. В одну из них кладут слюдяную пластинку размером 4 х 4 см, в центре которой приклеивают вторую слюдяную пластиночку (0,9x0,9 см) каплей раствора Рингера или сильно разведенной плазмы. На последнюю наносят одну каплю плазмы и равномерным слоем размазывают ее по пластиночке копьем. Крышку чашки Петри с заготовленными кусочками ткани наполовину приоткрывают, кусочек ткани подхватывают копьем и переносят в каплю плазмы, а затем покрывают каплей эмбрионального экстракта, разведенного пополам или сывороткой, или же жидкостю Тироде. Через некоторое время плазма свертывается.

Во второй чашке Петри помещается предметное стекло размером 5x5 см с круглым углублением, диаметром 2,5х2,5 см. Края стекла смазывают стерильным вазелином, на дно углубления наносят одну каплю рингеровского раствора для увлажнения камеры. После свертывания плазмы слюдяную пластинку захватывают пинцетом, осторожно переворачивают и накладывают предметное стекло. Легким нажатием пластинку плотно прикрепляют вазелином к стеклу, края пластинки кисточкой или ватным шариком смазывают расплавленным парафином, затем культуру переносят в термостат.

Посадка тканей па часовых стеклах. В чашке Петри размещается часовое стеклышко. На дно его капают одну каплю плазмы, помещают кусочек ткани и прибавляют одну каплю разведенного эмбрионального экстракта. После свертывания плазмы стеклышко переворачивают или над предметным стеклом, соответствующего размера, или же над полоской оконного стекла. П. Авроров и А. Тимофеевский не опрокидывали часовое стеклышко, а покрывали его часовым стеклышком меньших размеров и края заливали парафином. Периодическое подкармливание культур производится по одному принципу: удаляют парафин, вскрывают влажную камеру, топким пинцетом захватывают маленькую пластиночку с тканевой культурой и промывают в растворе Рингера или Тироде, затем вновь приклеивают к слюдяной пластинке. На твердую фазу наносят одну каплю эмбрионального экстракта, разведенного или жидкостью Тироде или же сывороткой. При разжижении среды наносят каплю плазмы.

Пассирование культур с разрезанием. Промытую в растворе Рингера культуру разрезают на две равных части. Кусочки промывают и вновь помещают в новую питательную среду. Дальнейшие манипуляции те же, что и при посадке ткани.

2. Методика культивирования в флаконах А. Карреля. Культивирование тканей производится в специальных флаконах Карреля. Перед стерилизацией в флаконы помещают четыре слюдяных пластиночки (0,7 х 0,7 см). В флаконы пипеткой наливают среду, служащую твердой фазой — 0,5 см3 плазмы, 0,5 см3 раствора Тироде, 0,25 см3 эмбрионального экстракта (практически соответствует 8, 8, 4 каплям). Слюдяные пластиночки правильными квадратиками распределяют в флаконе; копьем на каждую пластиночку помещают по одному кусочку ткани.

После свертывания твердой фазы во флаконы наливается жидкая фаза, состоящая из 0,5 см3 сыворотки и 0,6 см3 раствора Тироде (8 и 12 капель). Из стакана пинцетом берут прокипяченную обрезанную резиновую соску, обжигают горлышко флакона, на которое одевается соска. При обновлении питательной среды с флакона снимают резиновую соску, горлышко прожигают на спиртовке. После его остывания пипеткой с резиновым баллончиком (или резиновой трубочкой с пробочкой) отсасывают жидкую фазу. Во флакон наливают 10—15 капель раствора Рингера или Тироде, легкими покачиваниями культуры промывают. Жидкость отсасывают. В флакон прибавляют новую жидкую фазу: 0,5 см3 сыворотки, 0,6 см3 раствора Тироде, 0,25 см3 эмбрионального экстракта (8, 12, 4 капли). Горлышко флакона прожигают, закрывают новой прокипяченной соской, ставят в термостат.

При пассировании культур открытый флакон берут в левую руку, переворачивают вверх дном. Во флакон вводится копье. Вокруг пластиночек, на некотором расстоянии от зоны роста, плазму осторожно рассекают движением копья от периферии к центру. Тонким изогнутым глазным пинцетом (или зубным) пластиночки с культурами переносят в чашку Петри со стеклом с луночкой, в которой налито немного рингеровского раствора. Пластиночки с культурами перемещают на край предметного стекла. Обжигают копье и бритву (копье в левой руке, бритва в правой). Приоткрывают чашку Петри. Копьем слегка прижимают участок плазмы, который отсекают спереди и сзади, пластиночку поворачивают на 90°, обрезают остальные участки плазмы. При этом линия разреза проходит по наиболее густой зоне роста, отступя на 1—2 мм от основного кусочка ткани. Кусочки промывают в растворе Рингера. Разрезание кусочков надвое, четверо производится с целью быстро размножить хорошо растущую ткань, особенно в опытах, когда стремятся получить наиболее близкие, одинаковых размеров объекты опыта и контроля. После разрезания нередко наблюдается более интенсивный рост ткани. Кусочки промывают и помещают на новые слюдяные пластиночки в новую питательную среду, в новые флаконы.

Метод культивирования в чашках Карреля имеет существенные преимущества перед методикой «висячей капли». Своего высшего развития этот метод достиг в исследованиях А. Д. Тимофеевского, с успехом культивировавшего вне организма в течение длительного времени свыше 300 различных опухолей человека. В статье «Эксплантация опухолей» и в монографии «Эксплантация опухолей человека» А. Д. Тимофеевский подробно останавливается на особенностях выращивания вне организма опухолей животных и человека, характере роста, свойствах и др.

3. Методика, применяемая в нашей лаборатории. Взамен слюдяных пластинок применяются слегка продырявленные иглами целлофановые пластинки, размером соответствующие дну флакона Карреля, в которые они закладываются до стерилизации. При постановке культур на целлофановые пластинки наносят четыре капли сыворотки, одну-две капли плазмы, две-три капли раствора Тироде. На пластиночку помещают 4—6 кусочков ткани. Прибавляют две капли эмбрионального экстракта. После свертывания плотной фазы прибавляют жидкую плазму — 0,75 см3 сыворотки, 0,75 см3 раствора Тироде, 0,25 эмбрионального экстракта (20, 20 и 6 капель).

При пассировании культур пластинку вместе со всеми культурами переносят на предметное стеклышко, расположенное в чашке Петри. Для предохранения от высыхания наносят несколько капель рингеровского раствора. Вырезание культур производится с подлежащей целлофановой пластинкой. Зона роста при этом менее травмируется. Кусочки промывают и переносят в новую питательную среду на целлофановую пластинку.

Примененная нами модификация классического метода Карреля в значительной мере упростила саму постановку культур, упрощается и пересадка тканей. Плазмы, полученной от одной курицы, может хватить для работы одному человеку от одного до нескольких месяцев. Методика является пригодной для культивирования нормальных и опухолевых тканей животных и человека, особенно соединительнотканно-мышечного и нейро-глиального происхождения.

Методы культивирования тканей на заменителях плазмы

С момента возникновения метода культур тканей считалось, что нити фибрина плазмы играют роль механической опоры для растущих тканей. Поэтому плазму пытались заменить различными волокнистыми структурами (ватой, стеклянными нитями, фиброзной основой переваренного сальника и т. п.). Т. Люмсден, М. Лигнерис культивировали ткани в одной сыворотке, причем рост ткани происходил по стеклу. Из всех заменителей наибольшего внимания заслуживает предложенный В. Эрлом и сотрудниками метод «клеточных культур» на целлофане.

Методика Эрла. Для посадки берутся не тканевые кусочки, а клеточная взвесь обычно хорошо адаптированных к жизни вне организма в течение нескольких месяцев тканей, преимущественно соединительнотканного происхождения. В флаконы Карреля помещают продырявленные целлофановые пластинки до стерилизации, точно соответствующие (или несколько больше) размерам дна флакона. Посадка тканей производится пипеткой под целлофановые пластинки, которые прижимают клеточные элементы к стеклу. Рост происходит как по целлофану, так и по стеклу. При этом жидкую фазу в количестве 1 см3 , состоящую из 40% лошадиной сыворотки, 40% раствора Тироде и 20% эмбрионального экстракта, сменяют три раза в неделю. При пассаже клеточные элементы соскабливают с пластинок и стекла, образуют клеточную взвесь, которую пересаживают пипеткой в новые флаконы. Этот метод имеет большое значение при разработке специальных проблем, в частности для получения тканей в массовом количестве вне организма (до 1 кг и больше).

Метод культивирования ткани в насечках целлофана

Л. Ф. Арендаревский разработал новую методику культивирования тканей на целлофане, в частности, тканей нормального и раковоизмененного эпителия животных и человека. Использование метода культур при этом еще более облегчается. Эта методика является эффективной для получения чистых культур эпителия кожи, слизистых оболочек, внутренних органов, а также злокачественных опухолей. В ней соблюдены три основных принципа, крайне необходимых для получения чистых культур эпителия, а именно: создание условий для плоскостного роста эпителия, устранение разжижения питательной среды, губяще влияющего на рост ткани, и получение культур эпителия при отсутствии роста соединительной ткани. Рост происходит только в жидкой среде (сыворотке крови) на целлофане.

Методика заключается в следующем. Обычный целлофан разрезают на пластинки 1,5x2,5 см. Пластинки выдерживают в спирте, затем переносят в аппарат Сокслета, где происходит дальнейшее экстрагирование эфиром липоидных субстанций. Аппарат Сокслета можно заменить несколькими баночками с чистым перегнанным эфиром. В последующем эфир удаляют спиртом, а спирт — свежеперегнанной дистиллированной водой. В процессе обработки удаляют также глицерин, входящий в состав целлофана. Критерием для пригодности целлофановых пластинок является их прозрачность и хорошая смачиваемость. Целлофановые пластинки помещают в чашку Петри между листками фильтровальной бумаги и стерилизуют.

Обычным способом заготавливают тканевые кусочки. В чашку Петри помещают предметное стекло (обычно перевернутая камера Максимова). На стекло помещают целлофановые пластинки, цельные или же слегка перфорированные. Острым лезвием на целлофане делают пять-шесть сквозных насечек. Посадка ткани производится копьем и большой рекордовской иглой. Иглой расщепляют насечки и в них закрепляют краем тканевые кусочки. Глазным пинцетом пластинки с кусочками помещают в флакон Карреля. Для культивирования эпителия внутренних органов лучше всего фиксировать длинные узкие фрагменты эпителиальной ткани в двух насечках, расположенных одна против другой. В качестве жидкой фазы может применяться питательная среда следующих составов:

1. Сыворотки крови 1 см3, раствора Тироде 1 см3, эмбрионального экстракта 0,5 см3 (25, 25, 10 капель). Целлофановые пластинки свободно плавают в жидкости, чем обеспечивается хорошая омываемость культур.

2. Асцитической жидкости 1 см3, раствора Тироде 1 см3, эмбрионального экстракта 0,5 см3. Рост тканей животных нам удалось наблюдать и только при употреблении асцитической жидкости — 1 см3 и раствора Тироде — 1 см3, без экстракта.

Данная методика имеет то преимущество, что рост ткани происходит лишь по поверхности целлофана, благодаря чему исключается разрыв и разрушение ткани при движении пластинки, при пассаже и при приготовлении гистологических препаратов. При фиксации и окраске получаются чистые, хорошо контурируемые культуры. Рост эпителия происходит уже начиная со второго дня после посадки, обычно в 80—90% всех культур, причем даже на десятый день культивирования без пассажа отмечалось прогрессивное увеличение мембран без всяких признаков разрушения ткани.

Данная методика культивирования дала возможность получить чистые культуры эпителия пищевода, желудка, кишечника, легких, кожи, почки, печени, нейро-глиальной ткани мозга, а также эпителия аденокарциномы молочной железы, кроличьей карциномы Броун-Пирс. На целлофане отмечался хороший рост также различных перевивных сарком крыс. Мы впервые получили на целлофане рост раковых опухолей желудка, кишечника, молочной железы, глиальных опухолей центральной нервной системы человека. Для получения хорошего и закономерного роста раковоизмененного эпителия человека рекомендуется следующая методика.

Посадка кусочков тканей на целлофан и укрепление их в насечках производится по вышеописанному способу. На целлофан наносят одну каплю плазмы и одну каплю эмбрионального экстракта, две капли раствора Тироде, которыми покрывают кусочки. После свертывания прибавляют жидкую фазу — сыворотку человеческой крови, разведенную пополам раствором Тироде, пять-шесть капель экстракта из человеческих эмбрионов. Плазма при этом очень быстро разжижается. Крепление кусочков в насечках предохраняет их от выпадения в жидкую фазу. Продукты же расщепления плазмы являются очень мощными стимуляторами роста тканей, и вслед за разжижением происходит энергичный рост мембран раковоизмененного эпителия.

Методы изучений тканевых культур

1. Наблюдение живых культур под микроскопом. Этот метод исследования применяют в повседневной работе при желании иметь представление о времени и характере миграции тканевых элементов, начале и интенсивности роста, взаимоотношении тканевых структур и их превращений. При витальном окрашивании тканевых структур контуры тканевых элементов и некоторые прото плазматические структуры выделяются более отчетливо. Для витальной окраски используется нейтраль-рот в концентрации 1 : 50 000 — 1 : 80 000 или янус-грюн в концентрации 1 : 40 000, прибавляемые непосредственно в питательную среду. Широкое применение должно найти исследование живых культур в полузатемненном поле зрения, а также с использованием фазоконтрастной установки.

2. Определение интенсивности роста культур.

а) При визуальном наблюдении мощная пролиферация ткани обозначается + + + + , хороший рост + + +, рост ткани с одной или двух сторон кусочка + +, слабый рост +, начальные признаки роста, выхождение форменных элементов +/-, отсутствие роста — .

б) Измерение размеров зоны роста культур и отдельных клеток микрометром.

в) Планиметрия, зарисовка зоны роста культур при помощи рисовального аппарата. Непосредственно после посадки зарисовывают и измеряют площадь первичного кусочка. При росте культуры производят зарисовку и измерение площади первичного кусочка (А) и всей зоны роста (В). Определяется индекс роста (Ибелинга) В-А/А=I, т. е. прирост зоны роста культуры на единицу площади первичного кусочка. Коэффициент эффективности (К) определяется по формуле Io/Ik=K, т. е. соотношение индекса роста подопытных культур к контрольным. Этот коэффициент показывает во сколько раз энергия роста подопытных культур больше или меньше контроля.

Измерение площади культур производят прибором планиметром. Планиметрию можно заменить следующим способом: зарисовку культур рисовальным аппаратом производят на бумаге одного сорта под копирку в двух экземплярах. В копии вырезают рисунок первичного кусочка и зоны роста, которые взвешивают на торзионных (или простых) весах. Зная вес 1 см2 бумаги, можно вычислить площадь первичного кусочка и зоны роста. При изучении интенсивности роста обычно берут культуры первого или второго пассажа, имеющие более или менее равномерный рост. При этом культура разрезается на две одинаковые половинки — одна служит для контроля, а вторая для опыта.

3. Микрохимические методы исследования тканевых культур разработаны А. А. Кронтовским. Из них наибольшего внимания заслуживает метод определения количества сахара, поглощенного из питательной среды растущими тканями. Диагностическое значение, несомненно, может иметь тот факт, что опухолевые ткани значительно быстрее поглощают сахар питательной среды, нежели нормальные ткани. Этот метод требует строгого соблюдения одинаковых условий опыта и контроля в отношении количества и состава питательной среды, величины кусочка ткани, количества питательной среды, в которой определяется сахар по методу Хагедорн-Иенсена.

При культивировании тканей по методу «висячей капли» (Максимова) перед посадкой ткани маленькие слюдяные пластинки взвешивают на торзионных весах. На все слюдяные пластиночки наносят одной и той же пастеровской пипеткой (или лучше микропипеткой) одинаковое количество питательной среды (одну каплю плазмы и одну каплю эмбрионального экстракта), которую равномерным слоем распластывают на пластиночке. Все пластиночки со средой делятся на 4 группы: первая группа пластинок — только питательная среда без кусочка ткани, в которой определяют исходное количество сахапа; вторая группа - только питательная среда без кусочка ткани (или же с убитым кусочком), которая помещается на большую слюдяную пластинку, в камеру Максимова и в термостат одновременно с приготовленными культурами тканей и служит контрольной питательной средой (1-й контроль); третья группа — питательная среда с культурой. Если имеют в виду изучать воздействие на ткани каких-либо факторов, то вводится второй контроль — четвертая группа пластинок — питательная среда с культурой (без всякого воздействия).

Через 24—48 часов производится определение количества сахара. При этом культуры вместе с питательной средой к слюдяной пластиночкой взвешивают на торзионных весах. Вычитая вес слюдяной пластиночки, определяют вес питательной среды вместе с культурой. В этой среде определяется количество сахара, причем в раствор для анализа погружают пластиночку вместе с культурой. Обычно для анализа лучше брать по две культуры каждой группы (общий вес их составляет примерно 100—120 мг). Количество сахара выражается в процентах или миллиграмм-процентах. Сахар в контрольной питательной среде принимают за 100%. После определения количества сахара во всех четырех группах питательной среды можно установить количество сахара, потребляемого культурами подопытной и контрольной группы. При этом из данных первого контроля вычитается количество сахара третьей и четвертой групп. Сравнивая первую и вторую группы, можно иметь представление о количестве разложившегося сахара под влиянием ферментов плазмы и эмбрионального экстракта при нахождении питательной среды в термостате.

При культивировании тканей в чашках Карреля на целлофане определение количества сахапа производят следующим образом. Предварительно составляют смесь питательных веществ (сыворотка, раствор Тироде, эмбриональный экстракт в соотношении 2 ; 2 ; 1). В флаконы прибавляют одинаковое количество питательной среды (по 20 капель одной и той же пастеровской пипеткой или по 1 cм3 микропипеткой). Для этой цели удобно пользоваться стерильной микробюреткой. Флаконы с питательной средой разделяют также на четыре группы. На пластинки целлофана помещают равное количество примерно одинаковых кусочков. Учитывая, что в один флакон вводится несколько культур, можно определить их общий вес с тем, чтобы в последующем рассчитывать поглощение сахара на единицу веса ткани. Практически можно получить вполне сравнимые данные без определения веса ткани, условно принимая его одинаковыми в опыте и контроле. Для анализа микропипеткой берут 0,1 см3 питательной среды.

Метод определения количества потребляемого сахара особенно ценен в тех случаях, когда культуры, сохраняя жизнеспособность, не дают роста вне организма в силу своих биологических особенностей (например, кора головного мозга, корковое вещество почки взрослых животных) или же подвергаются воздействию угнетающих агентов (рентгеновы лучи, радий и др.). Обычно метод определения потребляемого сахара сочетается с одновременным определением интенсивности роста тканевых культур. Для получения более точных данных при изучении влияния различных факторов на рост тканей из состава питательной среды следует исключить эмбриональный экстракт.

4. Метод двойных культур или культур с капилляром (А. Чектани). Сущность метода двойных культур состоит в том, что к исследуемой культуре на расстоянии 1—2 мм подсаживается кусочек ткани, например, эндокринной железы. При методе культур с капилляром возле культуры на расстоянии 1—2 мм укрепляется очень тонкая капиллярная трубочка длиной 10—15 мм с одним запаянным концом. В этот капилляр пипеткой с очень тонко оттянутым на огне кончиком вводится экстракт из различных эндокринных желез, селезенки, лекарственные вещества, витамины и др. Обычно при росте культуры образуется равномерный венчик зоны роста вокруг первичного кусочка. При помещении же рядом другого кусочка или капилляра с исследуемым веществом характер роста культуры изменяется. Если кусочек ткани (например, эндокринной железы) или экстракт из этого органа в капилляре оказывает стимулирующее влияние на ткань, в сторону к кусочку ткани железы или к капилляру происходит интенсивный рост ткани исследуемой культуры, направленный в виде треугольника, при сравнительно меньших размерах зоны роста с противоположной стороны. Это обозначается как положительный бластотропизм (+). Если же, наоборот, отмечается угнетающее действие, со стороны кисочка железы или капилляра, рост культуры происходит более замедленно, заметно отставая от величины зоны роста ткани с противоположной стороны (так называемый отрицательный бластотропизм -).

5. Микрофотография живых культур или же окрашенных препаратов.

6. Фиксация и морфологическое исследование окрашенных тотальных препаратов. Фиксация культур производится в 2 % рингер-формалине. Лучшими фиксаторами для культур эпителия является жидкость Буена (насыщенный раствор пикриновой кислоты — 15 см3, формалин — 5 см3, уксусная кислота (1 см3), для соединительнотканных структур — жидкость Ценкера (сулема — 5,0 калий двухромовокислый — 2,5, натрий сернокислый — 1,0 дистиллированная вода — 100 см3). Перед употреблением прибавляется 5 см3 уксусной кислоты. Фиксация культур производится в течение 0,5—1,5 часа.

Окраска тотальных препаратов производится гематоксилином Вейгерта, Каррачи, Гейденгайна и др. При фиксации в рингер-формалине окраска гематоксилином тотальных препаратов производится по следующей схеме: промывание в водопооводной воде — 3—24 часа, в дистиллированной воде — 1 час, окраска гематоксилином Каррачи — 2—24 часа, промывание в дистиллированной воде — 30 минут, дифференцировка (при необходимости) в солянокислом спирте, проведение через спирты 70—80—96—100°, ксилол I — 5 минут, ксилол II — 5 минут, заключение в канадский бальзам. Обычными гистологическими методами можно готовить и срезы культур.

Краткая морфологическая характеристика основных типов тканевого роста

Росту тканевых культур после помещения их в термостате предшествует латентный период от нескольких часов до двух-трех дней. В первую очередь происходит миграция большей частью быстро дегенерирующих лимфоидных элементов и отдельных клеток культуры. Затем вокруг кусочка начинается равномерный (не всегда) так называемый экстенсивный рост ткани. Клеточные элементы образуют связанные друг с другом соединения, определенной для каждой ткани структуры. При культивировании соединительной ткани обычно происходит рост длинных вытянутых фибробластоподобных элементов, которые, взаимно переплетаясь, образуют густую сетевидпую зону роста, разрыхляющуюся к периферии.

Для роста тканей эпителиального происхождения в насечках целлофана наиболее характерен рост эпителия в виде тонких, экстенсивно стелящихся вокруг кусочка мембран, образованных плотно прилегающими друг к другу клеточными элементами, с четкими клеточными границами, между которыми иногда видны межклеточные мостики. При культивировании кусочков органов, а также раковых опухолей в плазме происходит гистотипический рост эпителия, который сопровождается одновременным ростом соединительной ткани, препятствующей длительному росту эпителия. Нередко наблюдается и цитотилический рост эпителия, когда из кусочка выселяются отдельные изолированные эпителиальные клетки, сравнительно быстро погибающие среди мощно растущей соединительной ткани.

Рак желудка. Рост культур опухоли начинается обычно на третий-пятый день культивирования. Зона роста сравнительно быстро увеличивается в размерах с образованием тонких, больших, однослойных экстенсивно растущих мембран. Эпителиальные клетки плотно прилегают друг к другу, клеточные границы отчетливо выражены, наподобие паутины оплетающие всю поверхность эпителиальной мембраны. При этом к одной клетке могут прилегать своими границами пять-семь соседних клеток, чем обусловливается полиморфизм клеток.

В других случаях клеточные элементы рыхло прилегают друг к другу, образуя довольно характерные гроздьевидные скопления раковых клеток. Клеточные элементы отличаются исключительным полиморфизмом, различной величиной. Цитоплазма клетки гомогенна, местами мелкозернистая. Интенсивность окраски цитоплазмы гематоксилином падает от окружающей ядро части цитоплазмы к периферии. Эта неравномерность окраски и пузырькообразное ядро, содержащее одно-два ядрышка, придают клетке округлую элипсоидную форму. В зоне роста можно отметить двух-трех и многоядерные клетки. В отдельных участках зоны клеточные элементы очень плотно прилегают друг к другу, образуя многослойные скопления клеток, вернее ядер, так как цитоплазма очень слабо выражена. От этих скоплений, соединяясь цитоплазматическими отростками, отходят отдельные раковые клетки.

Рак прямой кишки. Рост культур начинается на четвертый-шестой день. На 10—12-й день общая картина представляется в виде отдельных гнезд ракового эпителия. Эти гнезда состоят из плотно прилегающих друг к другу эпителиальных элементов кругло-овальной, призматической формы, переходящих по направлению к первичному кусочку в тонкий тяж того же строения, напоминающий по сходству ножку полипа. В данном случае вне организма выразилась своеобразная тенденция роста эпителия, напоминающая по сходству полипозный характер роста в организме.

Рак нижней губы. Культуры готовят из метастазов опухоли в подчелюстные железы. В жидкой среде на целлофане констатируется довольно хороший рост ракового эпителия. Преимущественно отмечается гистотипический характер роста, несколько реже наблюдаются экстенсивно растущие пласты, образованные сравнительно рыхло расположенными эпителиальными клетками.

Рак языка. При подозрении на рак языка берутся кусочки лимфатических желез, вырезаемые для патогистологического исследования. А. Д. Тимофеевский отмечает, что уже через два-три дня после посадки ткани лимфатической железы происходит рост крупных полигональных клеток, с округлыми крупными ядрами, содержащими одно-три ядрышка. Рост сопровождается разжижением фибрина, что обычно никогда не наблюдается при культивировании тканей нормальной лимфатической железы. Цитоплазма в общем светлая и лишь местами мелкозернистая. Клетки соединяются друг с другом межклеточными мостиками, местами отчетливо выраженными. В однослойной мембране можно найти участки, где клетки располагались в несколько слоев.

Рак легкого. При посадке ткани увеличенной шейной лимфатической железы А. Д. Тимофеевский получил рост опухолевых клеток. Раковые клетки, граничащие с соединительной тканью, имели кубическую или призматическую форму, тогда как в центре узла форма их была полиморфна. Помимо круглых и овальных, очень крупных ядер, часть клеток характеризовалась выраженным полиморфизмом ядер. Отмечались явления фагоцитоза (аутофагии) со стороны раковых клеток. Исходный материал изобиловал раковыми клетками в состоянии митоза, многие фигуры носили атипический характер.

Рак молочной железы. Для культур ракового эпителия молочной железы на целлофане характерен преимущественно гистотипический рост и значительно реже — рост в виде чистых культур ракового эпителия. С. В. Беневолинская отмечает, что раковые клетки в мембранах, а также в изолированном состоянии обладают выраженным палиморфизмом в отношении величины и формы. Р. Кемерон и Г. Чемберс при культивировании раковой молочной железы на третий-шестой день наблюдали появление на различных расстояних от посаженного кусочка одиночных и групп раковых клеток. Раковые клетки первичных опухолей молочной железы обладали способностью образовывать вне организма железистые альвеолы с некоторой функциональной активностью, выражающейся в появлении и выделении жировых капель в просвет альвеол. При культивировании метастазов рака молочной железы в лимфатические железы рост ракового эпителия происходит в виде плоскостных мембран.

Меланобластома. А. Д. Тимофеевский описывает следующие, характерные для меланобластомы клеточные элементы: 1) клетки с вытянутыми узкими ядрами и с длинным тонким клеточным телом, которое переходило на обоих полюсах в нитевидные отростки; 2) клетки звездчатой формы с круглыми овальными ядрами; 3) клетки, один конец которых закруглен, а от другого, грушевидно суживающегося конца отходило длинное нитевидное волокно; 4) клетки крайне причудливой формы с многочисленными нитевидными отростками. При длительном культивировании образуются типичные звездчатые комплексы. В культурах может содержаться большое количество меланина. При культивировании тканей сарком человека отмечается рост фибробластоподобных элементов.

Заключение

В настоящей работе в сравнительном аспекте рассмотрены методики культивирования тканей по обычному способу в плазме и по разработанному нами методу культивирования тканей в насечках целлофана, без применения плазмы, только в жидкой среде (сыворотке крови). Предлагаемый нами метод отличается значительной простотой по сравнению с обычной методикой. Манипуляции приготовления тканевых культур заметно упрощаются. Метод культур тканей в насечках целлофана имеет существенное преимущество перед существующими методиками, так как позволяет закономерно получать рост чистых культур нормального и раковоизмененного эпителия. Это открывает перспективы для более углубленного изучения природы рака, чувствительности злокачественных клеток эпителия к воздействию различных факторов, химиотерапевтических веществ и других лекарственных средств, рентгеновых лучей, радиоактивных изотопов, витаминов и др. Что касается культур нормального и раковоизмененного эпителия, то такие работы почти полностью отсутствуют.

Метод тканевых культур в насечках целлофана позволяет культивировать ткани только в сыворотке крови. Но ведь сыворотка может быть взята у животного и у человека при различных функциональных состояниях, в условиях воздействия на организм различных факторов. Это открывает возможности параллельного изучения различных воздействий на опухолевый рост в организме и вне организма. Например, можно изучать характер роста и метастазировапил опухоли при воздействии на организм животного и его нервную систему. Одновременно изучают, как влияет сыворотка крови данных животных на культуры тканей тех же опухолей. Получаемые данные имеют важное значение для выяснения роли гуморальной среды организма в патогенезе рака.

В комплексе с клинико-рентгенологическими и морфологическими методами постановка культур тканей может быть использована как вспомогательный метод при диагностике рака, а также как метод углубленного познания биологической сущности злокачественных новообразований человека.

См. далее: Эритроцитометрия >>





Питание при раке


Каким должно быть питание при онкологических заболеваниях? Какие продукты абсолютно противопоказаны при той или иной форме рака?

Узнать подробности >>


Фитотерапия в онкологии


Фитотерапия способна оказать существенную помощь не только в лечении онкологических заболеваний, но также и в их профилактике.

Узнать подробности >>


Наследственность и рак


Многих людей, имеющих у себя или у родственников онкологическое заболевание, интересует вопрос: передается ли рак по наследству?

Узнать подробности >>


Рак при беременности


Лечение рака во время беременности является довольно сложным, ведь большинство лекарственных средств обладает токсичностью.

Узнать подробности >>


Беременность после рака


Какие перспективы у беременности после перенесенного онкологического заболевания? Следует ли выдерживать срок после лечения рака?

Узнать подробности >>


Профилактика рака


Профилактика является важной частью общей борьбы с онкологическими заболеваниями. Как же уменьшить вероятность возникновения рака?

Узнать подробности >>


Паллиативное лечение рака


Что представляет из себя паллиативное лечение рака? Как оно может повлиять на качество жизни онкологического больного и изменить ее к лучшему?

Узнать подробности >>


Новые методы лечения рака


Учеными разработано достаточно много перспективных методов лечения рака, пока еще не признанных официальной медициной. Но все может измениться!

Узнать подробности >>


Статистика онкозаболеваний


Статистика заболеваемости раком, к сожалению, неутешительна: наблюдается рост числа заболевших, при этом болезнь «молодеет».

Узнать подробности >>


О «народной» медицине


Иногда «народными» методами удается победить рак, но тех, кто уповал только на них и в итоге покинул этот мир раньше времени - намного больше.

Узнать подробности >>


Как бороться с раком?


Как найти силы для борьбы с раком? Как не впасть в отчаяние от возможной инвалидности? Что может послужить надеждой и смыслом жизни?

Узнать подробности >>


Как помочь близким?


Как помочь близкому человеку жить с диагнозом «рак»? Нужна ли «ложь во спасение»? Как вести себя, чтобы близкие люди меньше страдали?

Узнать подробности >>


Стресс и рак


Бытует такое мнение, что постоянные стрессовые ситуации способны привести к развитию онкологических заболеваний. Так ли это?

Узнать подробности >>


Борьба с кахексией


Многие онкологические больные часто страдают от резкой потери веса. Чем это вызвано и можно ли как-то справиться с этой проблемой?

Узнать подробности >>


Уход за лежачими больными


Правила ухода за больными, вынужденными постоянно находиться в кровати, имеют свои особенности и их нужно обязательно знать.

Узнать подробности >>
Онкологический портал     Про наш сайт     Разместите информацию о своей клинике     Напишите нам     Литература     Поиск по сайту
© При цитировании материалов сайта гиперссылка на wincancer.ru обязательна.