Среди опухолей спонтанного происхождения наиболее известными и хорошо изученными являются рак молочной железы мышей, папиллома Шоупа кроликов и куриная саркома Рауса. Эти опухоли в силу легкости их воспроизведения в эксперименте и принадлежности к видам животных, легко разводимым в лабораторных условиях, стали классическими моделями опухолевого роста, с которыми работают онкологи всего мира. Все 3 опухоли оказались связанными в своем происхождении с вирусом или вирусоподобным агентом, поэтому вирусологические исследования проблемы рака проводятся в основном именно на этих моделях. Однако и для изучения многих других сторон проблемы рака, в частности терапии и профилактики рака, вопросов предрака и др., эти опухоли также являются ценными экспериментальными моделями.
Рак молочной железы мышей
Рак молочной железы — наиболее часто встречающаяся опухоль мышей. У мышей-самок имеется 5 пар молочных желез, расположенных под кожей в плоских тяжах жировой ткани, облегающих большую часть поверхности тела животного. Поэтому опухоли, возникающие в молочных железах, могут появляться в различных участках тела: около передних и задних конечностей, на шее (с боков и сверху), в паху, около заднего прохода. Обычно опухоль легко прощупывается, даже будучи еще маленьким узелком (2—3 мм в диаметре).
Мыши заболевают раком чаще всего в 10—12-месячном возрасте. Самые ранние случаи возникновения рака относятся к 3—6-месячному возрасту, самые поздние — к 2—2 1/2 годам, т. е. к самому концу жизни этих животных. Продолжительность жизни мышей со времени появления опухоли колеблется от 1 до 4 месяцев, будучи чаще всего равна 2—2 1/2 месяцам. Явления кахексии наступают обычно поздно и наблюдаются не всегда.
Иногда опухоли молочной железы вырастают до значительных размеров (до 3—3,5 см в диаметре), не вызывая гибели животного. Нередки случаи, когда мышь живет с опухолью, равной весу ее тела. Одновременно могут иметься не одна, а 2 или 3 опухоли, а иногда даже больше. Гистологически опухоли молочной железы мышей чаще всего имеют мелкоацинозную структуру, но они бывают и других типов.
Рак молочной железы метастазирует в легкие, но метастазы возникают лишь у небольшой части животных (не свыше 10%). Появлению видимой опухоли предшествует узелковая гиперплазия молочных желез, являющаяся предраковым состоянием. Гиперпластические узелки удобно наблюдать на тотальных препаратах молочных желез мышей (см. ниже).
Начиная с 40-х годов изучение рака молочных желез мышей привлекло большое внимание в связи с известным открытием Биттнера, показавшего, что этот рак вызывается особым агентом (так называемый фактор молока, или вирус Биттнера), передающимся через молоко кормящих самок. В ряде зарубежных лабораторий и в Советском Союзе проводятся исследования, направленные на выяснение этиологии и патогенеза этой опухоли и природы вызывающего ее агента. Факты, полученные в этих работах, показали, что фактор молока — это агент, обладающий всеми свойствами вирусов. Вместе с тем было показано, что одного только присутствия вируса недостаточно для возникновения рака. Для того чтобы возник рак, необходим высокий уровень эстрогенных гормонов, влияющих, как известно, на степень развития и пролиферации молочных желез.
Реализация действия фактора молока и гормонов возможна лишь при достаточной восприимчивости мышей к этим двум факторам. Таким образом, для того чтобы возник рак, необходимо наличие по крайней мере трех основных факторов: вирусного агента, эстрогенного гормона и восприимчивости организма к их действию.
Часто говорится о так называемом спонтанном, иди самопроизвольном, раке молочной железы мышей. Этот термин по существу является неправильным, так как рак возникает у мышей не самопроизвольно, а вызывается (при наличии остальных необходимых условий) возбудителем вирусной природы, передающимся от матери к детям через молоко. Однако, поскольку у мышей этот вид рака может возникать без вмешательства экспериментатора, название «спонтанный», или «самопроизвольный», рак пока еще остается в силе для удобства разграничения опухолей, возникающих в результате действия фактора молока, от опухолей, специально вызываемых с помощью химических канцерогенных и эстрогенных веществ или лучистой энергии. В дальнейшем мы будем говорить о спонтанном раке или просто о раке молочной железы, имея в виду опухоли, возникающие в результате действия именно фактора молока. Об опухолях этого органа, вызываемых другими агентами, сказано в других разделах книги.
Вызвать опухоли молочной железы у мышей можно двумя путями. Первый путь — это разведение мышей и ожидание появления у них опухолей. При разведении мышей высокораковых линий с целью получения у них опухолей молочной железы важно иметь не только значительное по численности поголовье линейных мышей вообще, но и достаточное количество старых самок в частности, так как именно последние и являются основными «поставщиками» спонтанного рака молочной железы мышей. Другой путь получения опухолей молочной железы сводится к вызыванию их у мышей нераковых линий путем искусственного введения фактора молока. Если мышам, обычно не заболевающим раком молочной железы (например, линий СС57 и C3Hf), но восприимчивым к фактору молока, ввести этот последний, то у большинства самок возникнут опухоли. Как и у мышей высокораковых линий, опухоли начинают появляться после 5—6-месячного возраста и продолжают возникать в течение всего периода жизни мышей (около 2 лет).
Ниже приводится краткое описание методики получения рака молочной железы путем искусственного введения не раковым мышам фактора молока.
Источники фактора молока. Помимо самого молока, этот агент содержится в некоторых органах мышей высокораковых линий (селезенка, зобная железа, молочные железы, предстательные железы, семенные пузырьки), а также в крови и сперме. Особенно богатым источником фактора молока является ткань опухолей молочной железы (первичных и перевиваемых).
Приготовление тканевых экстрактов, содержащих фактор молока. Орган или опухоль извлекают в асептических условиях сразу после забоя животного, взвешивают, растирают 3—5 минут со стеклянным или кварцевым песком в ступке, смешивают с дистиллированной водой или физиологическим раствором для получения желаемой концентрации экстракта. Лучше всего для получения опухолей пользоваться разведением 1 : 10, но активность фактора молока сохраняется и при больших разведениях (иногда до 10 -6).
Полученный экстракт центрифугируют на обычной центрифуге (достаточно 15 минут при 1 500 об/мин), после чего надосадочную жидкость отсасывают пипеткой или просто сливают в другой сосуд и используют для фильтрования или непосредственно вводят животным. До центрифугирования экстракт можно оставить на ночь и дольше в рефрижераторе для лучшей экстракции, но и свежеприготовленные экстракты вполне активны. После центрифугирования надосадочную жидкость фильтруют через фильтр Зейтца, Беркфельда или через другие мелкопористые фильтры, но можно и не фильтровать, так как эта процедура необходима лишь для получения заведомо бесклеточного материала.
При манипуляциях по приготовлению экстракта следует иметь в виду, что низкие температуры фактор молока переносит хорошо, а повышенные — плохо. Так, при 37° он инактивируется в течение 1 года, при 60° — в течение 30 минут, а при кипячении достаточно 5 минут для полной инактивации. Практически в течение 2—3-часовой работы по изготовлению экстракта при комнатной температуре фактор молока остается вполне активным. Доза вводимого экстракта зависит от его концентрации. Обычно достаточно 0,1—0,2 мл на мышь 5—20% экстракта, чтобы опухоли возникли у большинства реципиентов. Иногда производят не одно, а несколько повторных введений фактора молока.
Способ введения фактора молока. Наиболее естественный способ — вскармливание мышей нераковой линии самками-кормилицами из раковой линии. Именно таким путем и было доказано существование фактора молока. Однако практически это самый неудобный способ и им пользуются редко. Можно вводить тканевые экстракты, содержащие фактор молока, или молоко с помощью специального зонда через рот (фактор молока в противоположность многим вирусам не инактивируется ферментами желудочно-кишечного тракта). В настоящее время подкожное и внутрибрюшинное введения этого агента, как весьма эффективные и простые, вытеснили из обихода введение через рот. Было также показано, что фактор молока можно вводить интраназально.
Возраст реципиентов. Возраст реципиентов имеет большое значение. Наиболее восприимчивыми являются мыши-сосунки. После 30-дневного возраста восприимчивость мышей к действию фактора молока снижается, а взрослые мыши практически невосприимчивы к действию этого агента, хотя он может накапливаться в их организме и передаваться с молоком потомству. Наиболее удобными реципиентами являются 1—2-недельные мыши. Они еще достаточно восприимчивы и вместе с тем уже не так малы, как новорожденные, и легко переносят инъекцию.
Содержание мышей с момента отсадки от матери до конца опыта. После отсадки от матери мыши-самки, которым был введен фактор молока, должны размножаться. У девственных мышей опухоли, как правило, возникают реже. Для того чтобы не перегружать банку или клетку лишним количеством животных, новорожденных мышей следует отсаживать. При такой системе содержания мышей самки рожают несколько раз подряд, не вскармливая или почти не вскармливая своих детенышей. Считается, что такое так называемое форсированное размножение способствует появлению большего числа опухолей. После того как каждая самка родила два или три раза, следует отсадить самца, чтобы мыши более не размножались. Начиная с 5-месячного возраста всех самок один раз в неделю осматривают и регистрируют все возникшие у них опухоли.
Контрольные мыши. Контрольные мыши по возможности должны быть из тех же пометов, что и подопытные. При разделении подопытных и контрольных животных в раннем возрасте, когда они еще являются сосунками, их можно метить путем отрезания кончика уха или хвоста. При отсадке от матери в возрасте 1 месяца мышей метят индивидуально. Описание процедуры и схемы меток приведено в статье о лабораторных животных. Подопытных и контрольных мышей, если это допускается по условиям опыта, можно содержать совместно.
В работах разных авторов приводятся различные модификации методики в отношении доз, способов приготовления и сроков введения экстрактов с фактором молока. Мы чаще всего употребляли 10% водные экстракты ткани опухолей или молочных желез мышей высокораковых линий после центрифугирования в течение 15 минут при 1500 об/мин в дозе 0,1—0,2 мл на мышь. Материал вводился внутрибрюшинно 7 — 15-дневным мышатам.
Большая продолжительность опытов по биологическому тестированию фактора молока, когда для решения того или иного вопроса приходится ждать появления опухолей у подопытных мышей до 1 1/2 лет, значительно затрудняет экспериментальную работу в области изучения природы и патогенеза рака молочной железы мышей. В поисках методики более быстрого определения присутствия фактора молока мы предложили судить о наличии этого агента не по появлению макроскопически видимых опухолей, а по развитию предопухолевых гиперпластических узелков в молочных железах мышей-реципиентов. Для возникновения гиперпластических узелков необходимы те же факторы или условия, что и для развития рака. Поэтому присутствие гиперпластических узелков в молочных железах самки указывает, что она содержит фактор молока. А так как гиперпластические узелки развиваются раньше, чем опухоли (в возрасте 7—8 месяцев их бывает уже много), то суждение о наличии или отсутствии фактора молока по ним позволяет сократить продолжительность опытов с 1—1 1/2 лет до 7—8 месяцев. При этом постановка и проведение опытов остаются такими же, как описано выше. Следует подчеркнуть, что для достоверного суждения о результатах опыта желательно иметь в сравниваемых подопытных и контрольных группах не менее, чем по 10 самок, и заканчивать опыт по достижении самками возраста в 7—9 месяцев, не позднее 12 месяцев, так как, согласно данным некоторых авторов, у самок старше года может развиваться узелковая гиперплазия молочных желез, не связанная с действием фактора молока.
Методика приготовления тотальных препаратов молочных желез мышей, которой мы пользовались в наших опытах, состоит в следующем. Молочные железы второй и третьей пары (считая от головы) от самок, не беременных и не лактирующих, удаляют вместе со шкуркой, тщательно растягивают на полоске фильтровальной бумаги, так, чтобы железа прилегала к бумаге, и опускают в фиксатор. Желательно брать материал от недавно забитых животных. От давно забитых животных, как правило, получают значительно худшие препараты.
Фиксатором служит жидкость Буэна (15 частей насыщенного водного раствора пикриновой кислоты, 5 частей неразведенного формалина и 1 часть ледяной уксусной кислоты). Можно употреблять также 10% формалин, смесь формалина с уксусной кислотой или другие фиксаторы. Продолжительность фиксации равняется 2—3 дням, но в случае необходимости материал может оставаться в жидкости Буэна без ущерба для качества препаратов в течение нескольких месяцев. После фиксации необходимо отделить железы от кожи и по возможности от мышц (окончательно отпрепаровывают железы после окраски). Затем железы промывают в 70—80° спирте обычно 2—3 дня, но можно и больше, проводят через спирты возрастающей крепости (96, 100°) до толуола (или ксилола) и оставляют в нем на ночь. На следующий день кусочки проводят через спирты убывающей крепости в воду и окрашивают.
Для окраски мы предпочитаем пользоваться гемалауном Мейера или гематоксилином, но возможны и разные другие окраски (кармин и др.). Продолжительность окраски в зависимости от красителя и объекта колеблется от 10 минут до 1 часа, обычно 15—20 минут. Окрашенные кусочки быстро дифференцируют солянокислым спиртам и помещают в чашечку с несколько раз сменяемой водопроводной водой до посинения. После окраски наступает весьма ответственный момент — окончательное препарирование. Для этого пинцетом с тонкими острыми концами железы тщательно отделяют (под бинокулярной лупой) от всех остатков мышц и соединительнотканных пленок. Остается только сама железа, погруженная в строму жировой ткани. Промытые в водопроводной воде железы помещают на ночь в 70° спирт, который извлекает из ткани остатки пикриновой кислоты.
Заключение препаратов производят обычным способом через спирт и толуол (или ксилол) в бальзам. После абсолютного спирта препараты просветляют в каяпутовом масле (можно в бергамотовом, гвоздичном, мятном и т. п.). Готовые препараты на следующий день помещают под груз или в зажим для того, чтобы они были хорошо расправленными. На хорошем препарате протоки и альвеолы молочной железы окрашены в темный сине-лиловый цвет и резко выделяются на светло-голубоватом фоне окружающей ткани. Гипер
пластические узелки видны в виде очаговых гроздевидных разрастаний адинусов.
Главные условия, обеспечивающие хорошее качество препаратов (помимо правильной фиксации и окраски): 1) свежесть материала; 2) хорошее расправление железы при фиксации; 3) тщательная очистка ее от окружающих тканей.
Большой интерес представляет вопрос о сходстве и отличии рака молочной железы мышей от рака молочной железы человека. Этот вопрос интересен не только с точки зрения
наших общих представлений об этиологии и патогенезе опухолей, но и с точки зрения пригодности рака мышей в качестве модели соответствующей нозологической формы человека.
Рак молочной железы мышей характеризуется прежде всего значительно большей доброкачественностью по сравнению с соответствующей опухолью человека. У мышей эта опухоль может, как говорилось выше, достигать весьма значительных размеров и в таком состоянии мышь может жить на протяжении нескольких недель и даже вскармливать детей. Как правило, рак молочной железы мышей растет в виде хорошо отграниченного узла, не прорастая окружающих тканей. Опухоль метастазирует в легкие, но это, как указывалось выше, случается редко. Таким образом, по характеру роста и поведения рак мышей больше похож на доброкачественную опухоль, чем на злокачественную.
В морфологическом отношении рак молочной железы мышей также характеризуется большей доброкачественностью и нередко опухоли значительных размеров по отсутствию инфильтрирующего роста и по сравнительно слабой степени анаплазии больше похожи на аденомы, чем на аденокарциномы. Однако смертельный исход заболевания, способность к продолжению роста опухоли при перевивке ее другому животному и наличие метастазирования служат критериями злокачественной природы этой опухоли мышей.
Другим морфологическим отличием рака мышей является то, что он чаше всего возникает из эпителия ацинусов и альвеол, тогда как у человека наиболее частой формой считается карцинома, исходящая из эпителия протоков. Интересно, что и по характеру предраковых процессов эти опухоли также несколько отличны. Рак молочной железы мышей, вызываемый фактором молока, развивается на фоне узелковой гиперплазии молочных желез. Раку молочной железы человека предшествуют разнообразные предраковые процессы очагового и диффузного характера (мастопатии, фиброаденомы).
В заключение следует подчеркнуть, что рак молочной железы мышей является одной из интереснейших моделей для изучения этиологии и патогенеза опухолей. Это объясняется следующим: 1) сравнительно частым развитием у самок-мышей рака молочной железы — опухоли, весьма распространенной и у человека; 2) легкостью наблюдения за появлением рака в молочных железах мышей; 3) возможностью изучения морфологии предраковых изменений и рака, возникающих без какого-либо вмешательства со стороны экспериментатора; 4) возможностью при желании искусственно заражать мышей фактором молока при различных контролируемых условиях опыта; 5) явным участием агента вирусной природы в этиологии этой опухоли; 6) сложной зависимостью возникновения рака от действия вирусного агента и гормонов.
Это перечисление показывает, что на примере рака молочной железы мышей можно изучать различные проблемы этиологии, патогенеза и терапии злокачественных опухолей. И действительно, указанная модель использовалась в работах по изучению природы и роли вируса, вызывающего рак, по изучению роли гормонов в генезе этого заболевания, морфологии предраковых процессов и их перехода в рак, по иммунологии рака, изучению роли нарушения нервной регуляции в патогенезе опухолевой болезни, по выяснению некоторых других особенностей патогенеза этого заболевания (влияние возраста, диеты, физиологического состояния самок, влияния внешних условий на возникновение и рост опухолей и т. п.) и в работах по экспериментальной терапии.
Вирусная папиллома кроликов (папиллома Шоупа)
Вирусная папиллома кроликов является заболеванием с длительным циклом доброкачественного развития в виде кожных папиллом, превращающихся затем в плоскоклеточные формы рака. В естественных условиях папиллома встречается у диких кроликов вида Sylvilagus floridanus как эндемическое заболевание в некоторых штатах Америки.
Первое описание папилломы кроликов было сделано в 1933 г. Шоупом и им же установлена возможность экспериментального перенесения заболевания бесклеточным материалом как на диких, так и на домашних кроликов. Шоуп показал, что из различных способов заражения кроликов (внутривенно, внутрикожно, аппликациями в скарифицированную кожу) наиболее эффективны втирания вируса в скарифицированную кожу. Папилломатозные разрастания могут быть вызваны вирусом папилломы кроликов только у кроликов и зайцев; другие животные (морские свинки, мыши, крысы, собаки, козы, кошки) не восприимчивы к этому заболеванию.
Вирус папилломы проявляет строгий тропизм к кожному эпителию. Попытки вызвать первичное заболевание у кроликов во внутренних органах и в других тканях, кроме эпителия кожи, оказались безуспешными. Однако у кроликов, имеющих папилломы в коже, можно получить развитие аутотрансплантатов папиллом в различных органах путем пересадки туда клеток опухоли из первичных разрастаний.
В Советском Союзе первые пассажи вируса папилломы на беспородных домашних кроликах проведены Н. Н. Петровым в Сухумской лаборатории онкологии в 1931 г. Полученный штамм (кусочки папиллом в 50% глицерине) был использован для прививок местным домашним кроликам в 5 приемов, причем последняя успешная прививка была сделана через 10 1/2 лет исходным материалом, хранившимся все годы в 50% глицерине. Папилломы, развившиеся в результате прививок исходным штаммом, служили материалом для дальнейших пассажей вируса.
Многолетние наблюдения показали, что американский штамм папилломы хорошо адаптировался на местных домашних кроликах. По материалам Сухумской лаборатории онкологии, папилломы появляются в коже туловища через 3—5 недель после прививки, в коже ушных раковин инкубационный период более продолжителен (4—10 недель).
Положительные результаты прививок наблюдались в 84,4% случаев, спонтанное рассасывание папиллом — в 15,5% случаев. Прогрессивно развивающиеся папилломы, как правило, подвергались малигнизации почти в 100% случаев в сроки от 6 до 36 месяцев после прививки, причем у 83% кроликов папилломы малигнизировались в сроки от 7 до 18 месяцев. Длительность жизни кроликов с малигнизированными папилломами колебалась от 8 до 39 месяцев после прививки; у 50% кроликов, погибших с наличием рака, обнаруживались метастазы в регионарных лимфатических узлах и в легких.
Методика перевивок
Для получения прививочного материала выбирают кроликов с наиболее активно развивающимися папилломами через 2—6 месяцев после прививки. Шерсть около папиллом выстригают, затем остроконечными ножницами срезают папилломы чуть выше основания. Кровоточащую поверхность закрывают ватными тампонами, затем присыпают сульфаниламидными препаратами. Из оставшегося эпителиального слоя в основании папиллом, высотой около 2—3 мм, через некоторое время (1 —1 1/2 месяца) вновь образуются разрастания, не менее первоначальных, и их можно срезать повторно.
Срезанные папилломы, отмытые от крови физиологическим раствором поваренной соли, можно использовать для прививки в свежем виде или после более или менее длительного хранения в стерильном 50% глицерине (смесь глицерина и физиологического раствора при pH 7,0). Для длительного хранения флаконы или пробирки с прививочным материалом запаивают или герметически закупоривают и помещают в рефрижератор с температурой +4°.
Перед прививкой папилломы отмывают от глицерина (или используют без промывания) и растирают в ступке с кварцевым или стеклянным песком до гомогенной массы, затем добавляют физиологический раствор в количестве 3—5 частей по отношению к весу взятой папилломы. Для обычных прививок можно пользоваться суспензией вместе с песком без центрифугирования; для других опытов суспензию подщелачивают 1—3% раствором NaOH до pH 7,2—7,4, затем центрифугируют при 3000—4000 об/мин в течение 20 минут. Для опытов используют надосадочную жидкость. В зависимости от количества биологически активного вируса для прививок могут быть пригодны и более разведенные суспензии папиллом (1:10—1:20). Количественное определение вируса производят прививкой центрифугированных титрованных суспензий. Каждому кролику можно привить до 10—12 проб суспензии в разных разведениях.
Прививочный материал можно хранить также в замороженном или высушенном состоянии. Перед замораживанием срезанные папилломы обычно не отмывают от крови. Замораживание производят в пробирках или стеклянных банках в течение 5—10 минут при температуре —70° (смесь ацетона с сухим льдом). Замороженный материал хранят в рефрижераторе при температуре от —20° до —40°. Перед употреблением папилломы оттаивают и отмывают от крови. Методика приготовления суспензий такая же, как и при использовании материала, хранившеюся в 50% глицерине.
Для хранения вируса в высушенном состоянии готовят суспензии при pH 7,2—7,4 указанным выше способом. Центрифугированные при 3000—4000 об/мин суспензии могут быть дополнительно осветлены фильтрованием через бумажную пульпу на воронке Бюхнера или центрифугированием при 6000—8000 об/мин в течение 20—30 минут. К суспензиям или фильтратам добавляют 2—8% сахарозы, и материал разливают в ампулы для сушки. Содержимое ампул замораживают при температуре —70° и высушивают в замороженном виде под вакуумом. Запаянные ампулы хранят при температуре +4°. Пользуясь высушенным материалом, можно концентрировать вирус в 2—4 раза, растворяя содержимое ампул в соответственно меньшем объеме жидкости.
Прививки производят беспородным домашним кроликам с различной окраской шерсти в возрасте от 2 месяцев и больше. Существенного влияния возраста кроликов на исход прививок не отмечено, однако мы предпочитаем пользоваться взрослыми кроликами, так как у молодых крольчат кожа легко повреждается при удалении с нее шерсти. На боковых поверхностях туловища прививаемых кроликов намечают один или несколько участков кожи, с которых удаляют шерсть выщипыванием, выстриганием или бритьем. Кончиком скальпеля наносят густую сеточку царапин или лезвием скальпеля соскабливают поверхностный слой эпидермиса. На скарифицированную таким образом кожу наносят прививочный материал в объеме 0,3—0,5 мл и втирают его стеклянной лопаткой или шпателем.
В Сухумской лаборатории онкологии привитые кролики содержатся круглый год в клетках, расположенных под навесом, защищающим только от осадков. В более северных широтах таких кроликов в зимнее время следует переводить в теплые помещения во избежание отморожений растущих папиллом или кожи, обнаженной после прививки. В таких условиях штамм папилломы успешно поддерживается уже на протяжении ряда лет в отделе, руководимом Л. А. Зильбером, Института эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи (Москва).
Клиническая картина и морфология папиллом
Папилломы появляются чаще всего через 3 недели после прививки в виде шероховатых бородавчатых образований размерами с просяное зерно. По мере развития отдельные папилломы сливаются в сплошные щеткообразные массы или образуют рогообразные выросты. Гистогенетические исследования одного из авторов данного раздела (3. А. Постниковой) показали, что папилломы образуются в основном за счет эпителия волосяных фолликулов, реже — за счет покровного эпителия при участии волосяных фолликулов.
Через несколько месяцев после прививки развившиеся папилломы на гистологических срезах представляют собой мощные многослойные тяжи эпителиальных клеток с ясно выраженной дифференцировкой. Поверхностные слои эпителиальных разрастаний состоят из ороговевших клеток. Базальный слой, изобилующий митозами, четко отграничен от подлежащей соединительной ткани. Прогрессивно развивающиеся папилломы, как правило, подвергаются малигнизации. При этом микроскопически папилломы, имевшие серую окраску, становятся розовыми, сочными, иногда кровоточат, затем постепенно изъязвляются. При гистологическом исследовании в это время отмечаются переходные формы от папилломы к раку. Границы базального слоя эпителия нарушаются, усиливается воспалительная инфильтрация подлежащей соединительной ткани. В толще эпителиальных
тяжей также наступают изменения: клетки разрыхляются, становятся как бы отечными, межклеточные пространства и мостики четко выражены. Наблюдается обилие фигур деления, встречаются гигантские клетки. Далеко зашедший процесс малигнизации завершается образованием раковой язвы с твердыми валикообразными краями. Состояние кроликов к этому времени резко изменяется; они плохо поедают корм, наступает кахексия, затем гибель.
По гистологическому строению злокачественные опухоли и их метастазы представляют плоскоклеточные раки с большей или меньшей степенью дифференцировки клеточных элементов. У одного и того же кролика не все папилломы малигнизируются одновременно: образовавшаяся злокачественная опухоль в одном каком-либо участке может привести к гибели животного при наличии в других местах папиллом в доброкачественных стадиях развития. Вместе с тем малигнизация одной папилломы не препятствует злокачественному перерождению других папиллом через значительные промежутки времени (2 1/2—4 месяца). Развитие папиллом и их малигнизация протекают по-разному даже в группе кроликов, привитых одновременно одним и тем же материалом. Содержание вируса в папилломах может быть также различным. Иногда встречаются хорошо растущие папилломы, в которых биологически активный вирус не обнаруживается.
Некоторые сведения о вирусе папилломы кроликов
Вирус папилломы представляет собой сферические тельца в диаметре около 44 mм. Он обладает устойчивостью к некоторым физическим и химическим факторам: выдерживает прогревание при 67° в течение 30 минут, но инактивируется при 70°; сохраняет свою активность в кислой и щелочной среде в пределах pH 3,0:7,5 и полностью разрушается при pH ниже 3,0 и выше 9,0; устойчив к высокому давлению до 4000 атм и разрушается только при 6000 атм. Предельная длительность хранения вируса в 50% глицерине с сохранением активности не установлена, однако, по имеющимся данным, вирус не утрачивает своей биологической активности даже при 20-летнем сроке хранения.
Изучая инфекциозность очищенного вируса, Бирд показал, что 50% заболеваемости можно вызвать втиранием в 1 кв. дюйм скарифицированной кожи домашних кроликов 0,1 мл прививочного материала, содержащего около 80 300 000 частиц вируса; при использовании 10% экстракта это соответствует 8 030 000 000 частиц на 1 г ткани. Наименьшее количество вируса, способное вызвать папилломы у наиболее восприимчивых кроликов, соответствует 5 600 000 частицам. Обработка кожи кроликов скипидаром с метилхолантреном повышает чувствительность к вирусу в 10, 100 и более раз.
Существенно важным является тот факт, что инфекционный вирус удается выделить только из папиллом, находящихся в доброкачественной стадии развития. Из злокачественных опухолей, возникших из папиллом, инфекционный вирус не выделяется. Работами Л. А. Зильбера и его сотрудников было показано, что в малигнизированных папилломах не обнаруживаются и антигенные свойства вируса: у кроликов, иммунизированных экстрактами из раковых опухолей, возникших из папиллом, не образуется иммунитета к прививке вируса в кожу. Более того, экстракты из раковых опухолей блокируют как инфекционные, так и антигенные свойства вируса. Однако в литературе имеются указания на единичные случаи сохранения вируса в карциномах, возникших из папиллом. Так, Раус, Кидд и Смитт выделили вирус из трансплантируемых карцином V3 и V7. Эти факты нуждаются в дополнительном объяснении условий существования вируса в неблагоприятной среде.
Подобно другим инфекционным вирусам вирус папилломы адсорбируется эритроцитами разных животных. Известно, что у кроликов образуются антитела к вирусу при развитии папиллом, а также при иммунизации их экстрактами из папиллом. Кролики с рассосавшимися папилломами становятся невосприимчивыми к повторной прививке вируса. Титр иммунных антител зависит от количеств инфекционного вируса, содержащегося в экстрактах, применяемых при иммунизации. Антитела к вирусу папилломы могут быть обнаружены в реакции связывания комплемента, а также в реакции нейтрализации вируса.
В течение длительного времени оставался дискуссионным вопрос о так называемой маскировке вируса в некоторых папилломах. Концепция маскировки основывалась на наблюдениях об антигенной активности вируса в папилломах, в которых инфекционный вирус не обнаруживался. Однако более точные методы определения вируса в папилломах, из которых ранее вирус выделить не удалось, позволили Бирду подвергнуть справедливой критике эту концепцию. Бирд полагает, что дело не в маскировке, а лишь в концентрации вируса в папилломах, в некоторых случаях весьма низкой, неуловимой при определении обычными методами.
Роль вируса в процессе малигнизации папиллом до последнего времени остается неясной. Разрешение этого вопроса является важным не только для решения данной проблемы, но может иметь и общебиологическое значение. В заключение следует сказать, что папиллома кроликов является весьма удобной моделью для экспериментирования в разных направлениях, в том числе и для изучения факторов, тормозящих и ускоряющих опухолевый рост. Поверхностное расположение опухолей в коже удобно для макроскопических наблюдений и для микроскопических исследований. Обычно кролики хорошо переносят биопсии части папиллом во всех стадиях развития. Возможность поддержания штамма в разных климатических условиях при соблюдении определенного температурного режима в течение года позволяет рассчитывать, что вирус папилломы может быть с успехом использован для прививок кроликам в любой лаборатории.
Куриная саркома Рауса
В 1910 г. Раус, изучая спонтанную фибросаркому кур, обнаружил, что эту опухоль можно переносить на других кур не только с помощью клеточного трансплантата, но и с
помощью бесклеточного фильтрата. Так был открыт первый опухолеродный вирус.
В первое время перевивка опухоли клеточной суспензией и особенно воспроизведение саркомы с помощью фильтрата удавались с большим трудом и только у ближайших родственников (братьев, сестер) курицы — носительницы спонтанной опухоли. Однако затем опухоль была адаптирована к курам, и в настоящее время опухолевый рост легко воспроизводится с помощью опухолевой суспензии или фильтрата на чистопородных курах породы леггорн, плимут-рок и др. В нашей стране работа с куриной саркомой ведется главным образом на курах породы белый леггорн. Пассирование опухоли производят с помощью клеточной суспензии. Курицу с опухолью забивают, кусочек опухоли помещают в чашку Петри, тщательно освобождают от некротических и геморрагических участков, измельчают ножницами и суспендируют в физиологическом растворе или дистиллированной воде из расчета 5:1 по отношению к весу взятой для пассажа опухолевой ткани.
Приготовление суспензии должно проводиться при соблюдении всех правил асептики: работа около газа или спиртовки, стерилизация инструментов и посуды, тщательное ощипывание перьев и обработка йодом операционного поля и т. д. Если по каким-либо причинам работа ведется недостаточно стерильно, то для предотвращения бактериального загрязнения суспензии необходимо добавить к ней пенициллин из расчета 50—100 ЕД на 1 мл. Одним из основных правил работы с куриной саркомой является предотвращение возможности нагревания материала (тщательное охлаждение посуды и растворов, измельчение опухоли охлажденными ножницами и т. д.), так как вирус этой опухоли легко инактивируется при нагревании (см. ниже).
Полученную суспензию в количестве 1—2 мл вводят в грудную мышцу курице-реципиенту. Для пассажа лучше брать 12—14-дневную опухоль и прививать ее цыплятам в возрасте 1—3 месяцев. После введения суспензии в толще грудной мышцы уже через 3—4 дня начинает прощупываться опухолевый узелок, размеры которого быстро увеличиваются. Опухоль имеет вид слизистого геморрагического новообразования. Она обладает инфильтративным ростом и высокой степенью злокачественности. Привитые цыплята погибают от опухоли обычно на 18—20-й день. Опухоль Рауса представляет собой веретенообразноклеточную фибросаркому.
Вслед за этой опухолью была описана большая группа фильтрующихся куриных сарком, отличающихся от саркомы Рауса особенностями своего гистологического строения: круглоклеточная и полиморфноклеточная саркома, ангиомиксосаркома, хондрома, хондросаркома, остеосаркома, эпителиома и др.
Особый интерес, который представляет куриная саркома для экспериментальной онкологии, обусловлен присутствием в этой опухоли вируса. В электронном микроскопе этот вирус представлен элементарными тельцами, имеющими сферическую форму и располагающимися парами, группами и одиночно в цитоплазме опухолевых клеток. До последнего времени размер вируса, определяемый в опытах ультрацентрифугирования, фильтрации и электронной микроскопии, считался равным 67—80 mм. Однако в работе Геслера получены новые интересные данные, говорящие о том, что истинные размеры вируса значительно меньше (7—8 mм), а элементарные тельца, ранее принимаемые за одну вирусную частицу, представляют собой скопление вирусных частиц, связанных белковыми «мостиками».
По своему химическому составу вирус куриной саркомы представляет липонуклеопротеид, в состав которого входит рибонуклеопротеид и фосфолипоиды. Оптимальный pH для вируса саркомы находится в пределах 7,3:7,6. Колебания pH в пределах 4,0:12,0 не инактивируют вирус в течение 15—30 минут. Однако более длительное воздействие кислой или щелочной среды приводит к частичной или полной инактивации вируса. Изоэлектрическая точка вируса лежит в зоне 3,5: 4,0.
Вирус куриной саркомы, подобно инфекционным вирусам, чрезвычайно устойчив к действию низких температур. Его активность сохраняется несколько дней при температуре рефрижератора (от + 4° до + 6°) и в течение многих месяцев при температуре от —60° до —30°. Инактивация сравнительно быстро наступает при температуре термостата: наиболее активный вирус полностью теряет свою бластомогенную активность в течение 24 часов, а более слабый — в течение 3—6 часов. Нагревание фильтрата в течение 15 минут при температуре от +55° до +66° вызывает полную инактивацию вируса. Интересно отметить, что фильтраты, потерявшие активность в течение 4 часов при 37°, иногда вновь ее восстанавливали после пребывания в течение нескольких дней в леднике.
Губительное действие на вирус оказывает кислород. Поэтому предохранение от окисления (прибавление цистеина, цианидов, хранение в запаянных ампулах с выкачанным воздухом) способствует более длительному сохранению вируса. Хлороформ, толуол, 2% карболовая кислота, 50% спирт, ацетон и другие химические реагенты вызывают инактивацию вируса. Вирус очень устойчив к высокому давлению и инактивируется только при 4000 атм. Подобно многим инфекционным вирусам, вирус куриной саркомы сохраняется в 50% глицерине, хотя его патогенность при этом несколько ослабевает. Лучшим способом консервации вируса является его высушивание в анаэробных условиях при низкой температуре. Высушенный вирус сохраняет свою активность более 2 1/2 лет. Все сказанное необходимо учитывать при работе с вирусом куриной саркомы.
Как отмечалось выше, пассирование опухоли производят с помощью клеточной суспензии. Однако очень часто для постановки соответствующих опытов необходимо получение опухолевого фильтрата, содержащего вирус саркомы и лишенного опухолевых клеток. Методика приготовления такого бесклеточного фильтрата следующая. Опухолевую ткань, освобожденную от геморрагических и некротических участков, тщательно растирают 30—40 минут в ступке с песком и суспендируют в физиологическом растворе или дистиллированной воде из расчета 10: 1 по отношению к весу опухолевой ткани. К суспензии добавляют 10% раствор гиалуронидазы в таком количестве, чтобы ее конечная концентрация составила 0,1%. Обработка гиалуронидазой необходима потому, что саркома Рауса содержит большое количество гиалуроновой кислоты, делающей суспензию очень вязкой и затрудняющей все дальнейшие манипуляции с ней. Гидролиз проводят обычно в течение 15—20 минут до полного исчезновения вязкости, затем суспензию центрифугируют при 2500—3000 об/мин в течение 10 минут, и надосадочную жидкость фильтруют через свечи Беркефельда или Шамберлана L1—L5.
Приготовление фильтрата нужно проводить в асептических условиях, не допуская нагревания материала выше 6—8°. Для предотвращения нагревания при растирании опухоли ступку предварительно охлаждают в рефрижераторе, а во время растирания помещают в сосуд со льдом.
Фильтрование через свечи сопровождается большой потерей вируса, который адсорбируется на фильтрах. Поэтому в некоторых случаях для получения бесклеточного материала предпочитают повторно (дву- или троекратно) центрифугировать надосадочную жидкость при 3000—4000 об/мин по 10—15 минут или фильтровать надосадочную жидкость после однократного центрифугирования через толстый слой бумажной пульпы. Однако отсутствие клеток полностью гарантируется только при фильтрации материала через свечи. В том случае, когда необходимо измельчать большие количества опухоли, удобно пользоваться скоростным смесителем, позволяющим одномоментно обрабатывать до 100 г опухолевой ткани. В стакан помещают опухоль, дистиллированную воду или физиологический раствор и гиалуронидазу. Снаружи стакан обкладывают льдом или снегом. Измельчение в смесителе проводят в течение 5—8 минут.
Внутримышечное введение бесклеточного фильтрата курам вызывает у них образование опухоли, которая начинает прощупываться в толще мышцы через 8—10 дней и затем быстро увеличивается в размерах. Куры обычно погибают через 3—4 недели от опухолей или метастазов во внутренние органы. У 3—7% кур внутримышечные опухоли рассасываются, причем такие куры становятся невосприимчивыми к повторному введению им вируса или клеточной суспензии саркомы.
Во многих опытах приходится определять минимальную бластомогенную дозу вируса, т. е. то конечное разведение фильтрата, которое при введении курам вызывает образование у них опухолей. С этой целью из исходного фильтрата готовят последовательные пяти- или десятикратные разведения с помощью физиологического раствора или дистиллированной воды. Иногда фильтраты бывают чрезвычайно активны, и вирус дает образование опухолей в разведении 10 -6 — 10 -8. Разведения фильтрата, начиная от высоких к низким, вводят курам внутрикожно в количестве 0,2 мл. При этом в месте введения активного вируса через 8—14 дней появляются четко ограниченные внутрикожные опухоли, которые иногда достигают большой величины, метастазируют, и курица погибает.
В значительном проценте случаев внутрикожные опухоли рассасываются, и курица становится иммунной к повторной инокуляции вируса и клеточной суспензии саркомы. Метод внутрикожного титрования вируса особенно удобен в тех случаях, когда необходимо сравнительное изучение активности нескольких фильтратов или очищенных препаратов вируса. Дело в том, что индивидуальная восприимчивость к вирусу Рауса колеблется у различных кур в значительных пределах. Поэтому если активность различных препаратов сравнивается на разных курах, то может иметь место искажение результатов, обусловленное различной восприимчивостью кур к вирусу. В том случае, когда сравниваемые препараты вводят внутрикожно одной и той же курице, эта помеха устраняется. Метод внутрикожного титрования вируса выгоден также в экономическом отношении, так как здесь используют 2 кур вместо 40—50, как это имело бы место, если бы каждой паре кур вводили только один препарат.
Инкубационный период и течение опухолевого процесса зависят от ряда причин: активности фильтрата, возраста и индивидуальной восприимчивости кур, времени года.
Количество фильтрата, который может вызвать опухоль, колеблется в весьма значительных размерах. В некоторых опытах при работе с высокоактивным вирусом опухоль может быть вызвана при введении 0,001 мл фильтрата. С другой стороны, фильтраты, приготовленные из некоторых опухолей, вообще не содержат активного вируса. Этот факт связан с весьма интересной проблемой маскировки опухолеродных вирусов и зависит от присутствия в саркоматозной ткани кур ингибитора, блокирующего вирус.
Отмечено также влияние возраста кур на фильтруемость развивающихся у них опухолей: от цыплят и молодых кур неактивные фильтраты получают редко, а от кур старше 15 месяцев — более чем в половине случаев. Существенное значение имеет и возраст самой опухоли: имеются сведения, что активный вирус не удавалось выделить из опухолей, растущих более 40 дней. Активность фильтрата увеличивается при добавлении к нему кизельгура или других веществ, вызывающих повреждение клеток и клеточную пролиферацию, что в свою очередь способствует проникновению в клетки и усиленному размножению в них вируса Рауса. Вот почему при введении свежим курам фильтрата к последнему рекомендуется добавлять небольшое количество кизельгура.
Возраст привитых кур также существенно влияет на течение опухолевого процесса: с увеличением возраста восприимчивость к вирусу уменьшается. При введении вируса вылупившимся цыплятам у них чаще развивается так называемая геморрагическая болезнь (своеобразное заболевание, при котором наблюдаются множественные геморрагии в коже, слизистых оболочках и внутренних органах), чем опухоли. У более взрослых цыплят вирус вызывает появление опухолей, а иногда и геморрагической болезни одновременно. У взрослых кур введение вируса сопровождается возникновением опухолей и никогда не бывает геморрагической болезни. Эти данные свидетельствуют о том, что в ответ на инокуляцию вируса геморрагическая болезнь появляется у более восприимчивых цыплят, а опухоли — у менее восприимчивых взрослых кур. В 7—10% случаев взрослые куры вообще невосприимчивы к вирусу.
Помимо возраста, течение и исход опухолевого процесса зависят, как указывалось выше, от различной индивидуальной восприимчивости кур к вирусу саркомы Рауса. На прививаемость вируса влияет также сезонность: весной процент положительных прививок выше, чем зимой. По-видимому, это находится в связи с гормональной функцией, а также условиями питания и содержания кур.
Вирус Рауса с успехом культивируется в куриных эмбрионах, вызывая у них множественные геморрагии. При культивировании вируса в культурах тканей наблюдается размножение вируса, вызывающего превращение фибробластов в саркоматозные клетки. Он может поражать не только кур. Большие дозы вируса, введенные уткам не позже 24 часов после их вылупления, вызывают у них образование опухолей. Утиные варианты вируса Рауса дают образование опухолей, которые могут трансплантироваться фазанам, индюкам и голубям. В настоящее время Л. А. Зильбером, И. Н. Крюковой и Г. Я. Свет-Молдавским ведутся опыты по адаптации вируса Рауса к крысам и кроликам.
Таким образом, саркома Рауса может служить хорошей моделью для изучения возможности широкой адаптации опухолеродных вирусов. Несмотря на то, что вирус Рауса является в настоящее время одним из наиболее известных опухолеродных вирусов, его изучение представляет значительные трудности. Так, например, ни один из применяющихся в настоящее время физических, химических и физико-химических методов не позволяет полностью очистить вирус от «нормальных» тканевых белков. Тесная связь вируса с тканевыми белками делает невозможным дифференциацию его от нормальных тканей в реакции связывания комплемента и преципитации. Идентификация вирусного антигена удается с достоверностью только в реакции нейтрализации вируса сыворотками иммунизированных кроликов и морских свинок или сыворотками кур, имеющих опухоли. Особый интерес представляло обнаружение вируснейтрализующих антител в сыворотках кур с рассосавшимися опухолями или кур, резистентных к введению вируса.
В ткани куриной саркомы с помощью реакции анафилаксии с десенсибилизацией был обнаружен специфический антиген, отсутствующий в остальных тканях куриц. Как указывалось выше, среди кур существуют особи, резистентные к введению вируса. Повторное введение таким курам вируса в большинстве случаев оказывается безрезультатным. Однако если резистентным к вирусу курам привить опухолевые клетки, то у них возникают опухоли, достигающие большой величины и приводящие к гибели птиц. Таким образом, иммунитет к вирусу не сопровождается иммунитетом к опухолевой клетке. Этот интересный факт нуждается в глубоком и всестороннем изучении.
При работе с куриной саркомой 3. Л. Байдаковой и Р. М. Радзиховской удалось воспроизвести у кур искусственный иммунитет к вирусу этой опухоли. Однако иммунитет возник только у 38—41 % вакцинированных кур и не сопровождался появлением резистентности к опухолевым клеткам. Воспроизведение более напряженного иммунитета к вирусу, а также создание искусственной резистентности к трансплантации опухолевой ткани должны явиться объектами дальнейшего исследования.
Таким образом, саркома Рауса, являясь одной из наиболее хорошо изученных опухолей, представляет прекрасный объект для дальнейшего исследования ряда актуальных вопросов экспериментальной онкологии.
ПРИЧИНЫ И СИМПТОМЫ
