Вопрос о наилучших методах гетерологической трансплантации опухолей ни в коей мере нельзя считать решенным. Напротив, именно в последние годы в этой области ведется чрезвычайно интенсивная работа и почти каждый месяц в литературе появляются новые статьи по вопросам, связанным с гетеротрансплантацией. До сих пор мы не имеем такого метода, с помощью которого можно было бы успешно перевивать большинство опухолей человека на животных.
Задачей нашей работы является изложение тех методов, которые более всего распространены и применение которых дает наилучшие результаты. Мы не будем пытаться разобрать все методики гетеротрансплантации, описанные в литературе, и лишь кратко остановимся на теоретических вопросах, возникающих при разработке этой проблемы, так как эти вопросы более детально изложены в нашей обзорной статье.
Основной задачей, с которой сталкивается исследователь при гетеротрансплантации опухолей, является преодоление несовместимости донора и реципиента. Наиболее распространенные методы гетеротрансплантации можно разделить на две группы: 1) перевивка чужеродной опухоли в орган или организм, где не развиваются иммунные реакции на гетерологическую ткань (в мозг, в переднюю камеру глаза или куриным эмбрионом); 2) перевивка чужеродной опухоли реципиенту, у которого искусственно подавлены иммунные реакции (путем облучения рентгеновыми лучами или введения кортизона). Разберем подробнее каждый из этих методов.
Перевивка в переднюю камеру глаза
Этот метод использован в работах Е. Смирновой, Грина, Эйхвальда, И. А. Осиповой, А. К. Мулатовой и многих других. Чаще всего используют кроликов, мышей и особенно часто — морских свинок. Для перевивки в переднюю камеру глаза животное наркотизируют, пальцами или специальным расширителем отодвигают веки, острым глазным скальпелем делают небольшой надрез роговицы (по верхнему краю лимба или отступя от него на 1—2 мм), затем пинцетом проталкивают в надрез заранее заготовленный кусочек (диаметром 1—2 мм) опухолевой ткани.
Можно различать три стадии изменений трансплантатов в передней камере глаза: 1) стадия суспензирования: привитой кусочек находится в передней камере глаза; при этом, как правило, происходит частичное омертвение трансплантата; эта фаза длится 3—6 дней; 2) стадия оседания: трансплантат прикрепляется к радужной оболочке и васкуляризируется; длительность этой стадии варьирует от 3—7 дней до нескольких месяцев; 3) стадия роста, когда начинается заметный рост трансплантата; обычно этот рост (при прививке гетерологических опухолей, особенно опухолей человека) бывает медленным и продолжается до нескольких месяцев. Как правило, растущая опухоль не выходит за пределы глазного яблока. Лишь в отдельных случаях наблюдается прорастание роговой оболочки, следствием которого обычно бывает инфицирование трансплантата и его гибель. На любой из перечисленных стадий может наступить частичная или полная регрессия гетеротрансплантата.
Преимуществом метода трансплантации в переднюю камеру глаза является возможность прижизненного наблюдения за всеми изменениями привитого кусочка. Однако даже при интенсивном росте опухоли в передней камере размеры трансплантата остаются столь небольшими, что использовать их для серийных перевивок трудно. Поэтому если 10—15 лет назад прививка в переднюю камеру была самым распространенным методом гетеротрансплантации, то в последние годы она постепенно уступила место другим методикам.
Перевивка в мозг
Метод перевивки в мозг, предложенный Шираи, был затем использован в работах Мерфи и Штурма, Грина, Л. Я. Яблоновской, В. Н. Степиной, Ю.М. Васильева, А. И. Агеенко и др. В зависимости от вида животного методика перевивки в мозг несколько варьирует. Более крупных животных (кроликов, морских свинок, крыс) наркотизируют, привязав предварительно к станку, удаляют шерсть в области операционного поля и, обработав это поле йодом, делают скальпелем небольшой надрез кожи в теменной области (несколько кпереди от уха, отступя на 5—6 мм от средней линии). Края разрезанной кожи разводят пинцетом. С помощью бормашины делают трепанационное отверстие в черепе. Во время трепанации бор нужно прочно фиксировать на кости, но он не должен сильно давить на кость, иначе, пройдя через нее, он сильно повредит ткань мозга. После трепанации через сделанное отверстие в ткань мозга вводят троакаром или пинцетом кусочек опухоли. Троакары можно заменить иглами Дюфо для переливания крови (с несколько затупленными концами): кусочек заранее вводят в просвет иглы, а в момент прививки выталкивают мандреном из иглы, введенной в трепанационное отверстие. Если трансплантируемый кусочек не введен в ткань мозга достаточно глубоко, то после извлечения иглы или троакара он может выпасть наружу. После прививки на рану накладывают 1—2 шва.
Еще проще методика прививки опухоли в мозг мышам. Для таких перевивок удобно использовать троакары небольшого диаметра, сделанные из игл для пневмоторакса. Кусочек заранее закладывают в такой троакар. Мышь слегка «оглушают» эфиром. Указательным и большим пальцами левой руки фиксируют голову мыши, кожу головы смазывают йодной настойкой. Троакаром прокалывают кожу и кость черепа (несколько кпереди и выше уха, не доходя до средней линии), и кусочек выталкивают мандреном в ткань мозга, после чего иглу быстро извлекают. Отдельные животные иногда погибают через 1—3 дня после прививки, у остальных видимых изменений в течение более или менее длительного срока (от 6—7 дней до 4—5 месяцев) не обнаруживается. В поздние стадии роста трансплантата нередко появляются симптомы нарушения состояния центральной нервной системы: вялость, парезы, вестибулярные нарушения (постоянное «кружение»). У мышей отмечается также характерное выпячивание теменных костей. Обычно вскоре после появления этих симптомов животные погибают. На вскрытии у погибших или забитых животных обнаруживается опухолевый узел, чаще всего располагающийся на поверхности или в толще полушария мозга; обычно трансплантат более или менее четко отграничен от окружающей ткани.
Как видно из изложенного, метод прививки в мозг обладает одним существенным недостатком: почти до самого момента смерти животного судьба трансплантата остается неясной. В тех случаях, когда рост трансплантата незначителен, клинические симптомы повышения внутричерепного давления вообще не появляются, и опухолевую ткань удается обнаружить лишь при серийном гистологическом исследовании мозга забитых животных.
Гетеротрансплантация опухолей на развивающийся куриный эмбрион
Первое сообщение о возможности роста опухолей на развивающихся куриных эмбрионах было сделано Раусом и Мерфи в 1911 г. Затем этот метод был использован во многих работах. Гетеротрансплантацию опухолей на куриный эмбрион можно производить различными способами: на хорионаллантоисную оболочку, в желточный мешок и тело эмбриона. Наибольшее распространение имеет гетеротрансплантация опухолей на хорионаллантоисную оболочку. Для трансплантации применяют куриные эмбрионы 7—10-дневного возраста.
Перед опытом яйцо просвечивают и простым карандашом очерчивают границу воздушной полости и границу хорионаллантоисной оболочки, прилегающей к скорлупе. После этого поверхность яйца над воздушной полостью и боковую поверхность обрабатывают йодом и спиртом и скорлупу прокалывают копьем над воздушной полостью. На отмеченном участке сбоку пилочкой или диском при помощи бормашины осторожно выпиливают в скорлупе окошечко в форме трех-четырехугольника, каждая сторона которого приблизительно равна 5—6 мм. При этом нужно пропилить только скорлупу, не поранив лежащую под ней скорлуповую оболочку. Выпиленный участок скорлупы осторожно удаляют с помощью иглы, конец которой загнут под прямым углом. Той же иглой или глазным пинцетом осторожно надрывают скорлуповую оболочку, стараясь не ранить прилегающую к ней хорионаллантоисную оболочку.
Под давлением поступающего через проделанное отверстие воздуха хорионаллантоисная оболочка отделяется от скорлуповой, опускается, содержимое яйца перемещается, заполняя естественное воздушное пространство в тупом конце яйца, воздух из которого выходит через ранее проделанное копьем отверстие. Над опущенной хорионаллантоисной оболочкой образуется новое искусственно созданное воздушное пространство. Если хорионаллантоисная оболочка не опускается сама, то тогда резиновым баллончиком медленно отсасывают воздух через отверстие естественного воздушного мешка и таким образом способствуют перемещению оболочки и содержимого яйца. Если при разрыве скорлуповой оболочки нарушается целость хорионаллантоисной оболочки, то такое яйцо не пригодно для трансплантации.
На хорионаллантоисную оболочку помещают кусочек опухоли. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, накладывая его на валик полузастывшего парафина, или кусочком целлофана или скорлупы, которые сначала накладывают, а потом заливают парафином.
Можно трансплантировать опухоли на хорионаллантоисную оболочку другим методом. Для этого с тупого конца яйца после обработки его йодом и спиртом срезают ножницами скорлупу над воздушной полостью. Затем глазным пинцетом осторожно снимают скорлуповую оболочку и на обнаженную таким образом хорионаллантоисную оболочку помещают измельченную ткань опухоли с помощью шприца или кусочек опухолевой ткани размером 1 X 1—2 X 2 мм. Кусочки опухолевой ткани лучше помещать на то место хорионаллантоисной оболочки, где хорошо развита сеть кровеносных сосудов. Эмбрионы с трансплантированными опухолями закрывают стерильными стеклянными колпачками и инкубируют при температуре 37° в течение 6—7 суток. После этого срока инкубации эмбрионы вскрывают и выросшие опухоли перевивают на свежие яйца.
Последний способ гетеротрансплантации опухолей на хорионаллантоисную оболочку применяют чаще благодаря его простоте и легкости, хотя он и имеет существенный недостаток. Под воздушным пространством яйца скорлупная оболочка интимно связана с подлежащей хорионаллантоисной оболочкой и последняя часто травмируется при снятии скорлупной оболочки (частые кровоизлияния), что может ухудшать условия роста гетеротрансплантата и затруднять дальнейшие патоморфологические исследования.
Опухоли, развивающиеся на хорионаллантоисной оболочке, имеют вид узлов, возвышающихся на ее поверхности. Внешний вид опухолевого узла зависит от строения трансплантированной опухоли. Величина опухолевых узлов различна — от 2 мм до 2 см в диаметре. При трансплантации на хорионаллантоисную оболочку двух кусочков опухоли обычно оба дают рост и при вскрытии яйца на оболочке можно видеть две опухоли. Трансплантаты некоторых опухолей животных (лимфома мышей ЛИО-1, гепатома) дают слабый рост на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона и только в течение первых 2—3 пассажей, а в дальнейшем погибают.
Попытки выращивать человеческие опухоли на куриных эмбрионах в основном оканчивались неудачами. Только недавно удалось успешно вырастить три человеческих опухоли на хорионаллантоисной оболочке куриного эмбриона после предварительной трансплантации их на крысах и хомяках, обработанных кортизоном. Другие методы гетеротрансплантации опухолей на куриный эмбрион применяются реже.
Трансплантация опухоли в желточный мешок куриного эмбриона производится следующим образом. Используют 5—6-дневные эмбрионы. Инокуляцию производят через отверстие в скорлупе над воздушной полостью шприцем. Иглу вводят на глубину 3—4 см при горизонтальном положении яйца. Отверстие в скорлупе заливают парафином. Яйца инкубируют 10—12 дней. Метод гетеротрансплантации опухолей на куриный эмбрион имеет ряд преимуществ. В эмбрионе до 18-го дня инкубации не развиваются защитные силы организма, и чужеродная ткань может свободно расти.
Поэтому указанный объект можно использовать для гетера трансплантации без предварительной обработки. Трансплантация опухолей на хорионаллантоисную оболочку куриного эмбриона имеет наибольшее значение благодаря наличию широкого операционного поля, а также возможности наблюдать за ростом трансплантата через стеклянный колпачок или покровное стекло. Однако этот метод имеет и свои недостатки. В частности, для трансплантации можно применять только быстрорастущие опухоли, так как рост их лимитируется сроками инкубации яиц.
Перевивка на животных, получающих кортизон
Метод гетеротрансплантации опухолей на животных, получающих кортизон, предложен сравнительно недавно. Основанием для создания этого метода послужили данные о подавлении иммунных и аллергических реакций, вызываемых кортизоном. С наибольшим успехом этот метод применила Тулен, которой удалось получить 5 штаммов человеческих опухолей, постоянно трансплантируемых на животных, «обрабатываемых» кортизоном. Следует, однако, отметить, что причиной успеха Тулен были не только, а может быть, и не столько преимущества данного метода, сколько огромные масштабы работы: пробные опыты были ею поставлены более, чем с 1 000 опухолями человека.
До настоящего времени опубликовано уже значительное число работ по гетеротрансплантации опухолей на животных, получавших кортизон. Для таких опытов чаще всего используют крыс и хомяков. Опыты на животных каждого из этих видов имеют свои особенности. Для гетеротрансплантации следует брать крысят 3—4-недельного возраста (весом 30—60 г). Суспензию ткани перевиваемой опухоли вводят под кожу спины шприцем, так же как при гомологической трансплантации (см. статью о перевиваемых опухолях в данном сборнике). Немедленно после прививки под кожу (в отдалении от места трансплантации) вводят 2,5—5 мг кортизона. После прививки кортизон вводят животным повторно в тех же дозах два раза в неделю до конца опыта. Следует отметить, что кортизон оказывает выраженное токсическое действие на крысят, поэтому за подопытными животными необходимо постоянно наблюдать и при появлении симптомов интоксикации (общая вялость, исхудание, понос) прекратить инъекции кортизона или уменьшить его дозу. Если за 1—3 суток перед прививкой произвести общее облучение подопытных животных рентгеновыми лучами (в дозе 150—200 r), дозы кортизона можно сократить вдвое.
В ряде экспериментов (например, при перевивке крысам некоторых опухолей мышей) уже через 10—12 дней после трансплантации у крысят, получавших кортизон, образуются крупные опухолевые узлы, которые можно использовать для дальнейших перевивок.
Большинство злокачественных опухолей человека приживляется у крыс, получавших кортизон, однако значительного роста опухолей не происходит у животных, забитых на 12—14-е сутки, на месте трансплантации имеются лишь небольшие узелки, в которых при гистологическом исследовании обнаруживается опухолевая ткань. Больший интерес представляет метод перевивки гетерологических опухолей в защечные мешки хомякам. Так как при применении этого метода трансплантат растет под прозрачной слизистой оболочкой, исследователь может день за днем следить за всеми изменениями привитой опухоли. Все работы по гетеротрансплантации проводились на сирийских золотистых хомяках (Mesocricetus auratus) — животных, которых сравнительно легко разводить в лабораторных условиях.
Следовало бы попытаться поставить опыты по гетеротрансплантации и на хомяках других видов, в особенности встречающихся в пределах СССР. Прививку опухоли в защечный мешок хомяку производят следующим образом. У наркотизированного животного указательным пальцем выворачивают защечный мешок, слизистую его осторожно вытягивают наружу глазным пинцетом, расправляют и подсушивают марлей. Иглой шприца, содержащего опухолевую суспензию, прокалывают слизистую у основания мешка и проводят иглу под слизистой как можно дальше к вершине мешка, после чего вводят в мешок 0,1—0,2 мл суспензии. Можно вводить в мешок и кусочки опухоли с помощью небольшого троакара. Обычно производят перевивку в оба мешка. Для опытов берут, как правило, хомяков месячного возраста, весом 60—80 г, однако в некоторых случаях положительные результаты можно получить и при использовании более крупных животных. Одновременно с прививкой опухоли под кожу хомяку вводят 2,5—3 мг кортизона. В дальнейшем кортизон вводят в той же дозе 2 раза в неделю в течение всего опыта; при ухудшении состояния животных инъекции приходится временно отменять; 3—4 раза в месяц осматривают место перевивки, для чего у наркотизированного хомяка выворачивают пальцем защечный мешок (при некотором навыке обычно удается вывернуть мешок и без наркоза).
Некоторые гетерологические опухоли (например, некоторые штаммы мышиных опухолей) дают значительный рост в мешке уже через 10—15 дней после перевивки. Однако
трансплантаты многих новообразований человека начинают расти лишь через 2—3 месяца после прививки. Поэтому опыты с трансплантацией опухолей человека в защечные мешки хомякам обычно бывают довольно длительными. Тем не менее, по-видимому, именно этот метод из всех известных в настоящее время дает положительные результаты в наибольшем проценте случаев.
В литературе предложено большое число других методов гетеротрансплантации, однако они не нашли пока широкого распространения. Для успеха гетеротрансплантации важное значение имеет характер и состояние перевиваемой опухолевой ткани. Из опухолей человека лучше всего, по-видимому, прививаются плоскоклеточные раки и некоторые саркомы, хуже всего — раки желудка, лимфосаркомы и другие опухоли из лимфоидной ткани. Неблагоприятным фактором является наличие в трансплантируемой ткани больших количеств фиброзной стромы. Разумеется, перевиваемая ткань должна быть стерильной и не содержать участков распада. Рекомендуется обработать опухолевую ткань перед перевивкой раствором пенициллина (10 000—15 000 ЕД иа 1 мл физиологического раствора). Важное значение имеет интервал времени между удалением опухоли и ее перевивкой. Этот срок должен быть возможно более коротким, желательно не более 10—30 минут. При большем интервале меньше шансов на успех трансплантации.
Применение гетеротрансплантатов опухолей в качестве экспериментальной модели
С первого взгляда может показаться, что вопрос о сходстве гетеротрансплантатов человеческих опухолей и новообразований человека, наблюдаемых в клинике, решается чрезвычайно легко: ведь в данном случае мы экспериментируем непосредственно с опухолевой тканью человека, а не с опухолью животного. Однако дело обстоит не столь просто. Прежде всего некоторые свойства гетеротрансплантатов, например скорость их роста, детали морфологического строения и т. д., могут изменяться в ходе перевивки.
Особый интерес представляют появившиеся в последнее время данные о том, что длительно пассируемые опухоли человека утратили ряд антигенных компонентов, характерных для новообразований человека. Как далеко может зайти такая утрата антигенной специфичности, остается пока неясным. Однако в большинстве случаев, как говорилось выше, свойства опухолевой ткани при гетеротрансплантации долгое время почти не меняются. Тем не менее результаты опытов с гетеротрансплантатами (например, опытов по экспериментальной терапии) следует переносить в клинику с большой осторожностью, так как условия роста опухоли, привитой животному, резко отличаются от условий роста того же новообразования в организме человека.
При гетеротрансплантации имеется чрезвычайно неустойчивое равновесие между опухолью и организмом реципиента, и вызвать гибель трансплантата может любой агент, не только непосредственно действующий на опухолевую ткань, но и повышающий иммунитет реципиента к чужеродной ткани. Поэтому в опытах с гетеротрансплантатами нужно учитывать особенности данной модели.
Разумеется, из всего сказанного не следует делать вывод о том, что методы гетеротрансплантации опухолей не представляют большого интереса для онкологов-экспериментаторов. Напротив, в опытах с гетеротрансплантатами можно изучать ряд очень важных проблем теоретической онкологии: различные аспекты взаимоотношений опухоли и организма, в котором она растет, вопрос об изменчивости опухолевой ткани и т. д. Методы гетеротрансплантации могут оказать существенную помощь исследователям, изучающим биохимические особенности опухолей. В известной мере они могут быть полезными и при отборе химиотерапевтических противоопухолевых препаратов. Значительный интерес представляют попытки адаптировать некоторые вирусы к опухолям человека, трансплантируемым на животных. Целью этих экспериментов была селекция вариантов вирусов, избирательно разрушающих опухолевую ткань. Можно было бы значительно увеличить число примеров, иллюстрирующих перспективность использования методов гетеротрансплантации, однако и сказанного достаточно, чтобы показать ценность этой модели для решения различных проблем патогенеза и терапии злокачественных опухолей.
ПРИЧИНЫ И СИМПТОМЫ
