Метод культуры тканей и клеток за время своего 50-летнего существования нашел широкое применение при изучении различных вопросов биологии и медицины, но особенно прочно он укрепился в области вирусологии и онкологии. Методика культивирования тканей претерпела за эти 50 лет существенные изменения, однако значительный прогресс в получении массовых культур определенного вида клеток был достигнут лишь в последние годы. Это имело существенное значение для практического применения культур в области вирусологии. В области экспериментальной онкологии эксплантация клеток и тканей применяется при изучении самых различных вопросов этой науки.
Методики культивирования, применяемые для изучения тех или других вопросов онкологии, ничем не отличаются от методик, применяемых для изучения других вопросов биологии и медицины. Для культивирования опухолей животных и человека требуются те же питательные среды, что и для культивирования неопухолевых тканей. Поэтому приводимые в настоящей статье методики отнюдь не носят каких-либо специфических для онкологии особенностей.
Прежде чем перейти к рассмотрению различных методик культивирования клеток и тканей, следует остановиться на принципах организации лабораторий культуры тканей, изготовления и применения различных питательных сред, а также получения материала для культивирования.
Организация лаборатории
Основная предпосылка для успешности работы в лаборатории культуры тканей — это создание условий, обеспечивающих стерильность всех манипуляций, связанных с поддержанием и получением культур. Помещение лаборатории должно включать комнаты-боксы, где в асептических условиях производится работа по приготовлению культур и их пассированию. Применение бактерицидных ламп (ультрафиолетовых), борьба с пылью путем фильтрации воздуха и увлажнения помещений (например, обтирание раствором хлорамина), работа в стерильных халатах и масках — все это до известной степени обеспечивает надлежащую стерильность манипуляций.
Понятно, что питательные среды, посуда, инструменты, а также подлежащий культивированию материал должны быть стерильными. Специальную комнату нужно приспособить для стерильного взятия сыворотки, плазмы, кусочков тканей у животных, разливки стерильных солевых растворов и т. п. Стеклянную посуду (из нейтрального стекла или пиракса) стерилизуют сухим жаром при температуре 160° в течение 2 часов, солевые растворы, дистиллированную воду автоклавируют при температуре 120° в течение 20—30 минут. Для некоторых целей применяют также стерилизацию путем пропускания жидкостей через соответствующей порозности фильтры. Поэтому желательно иметь специальную комнату для стерилизации посуды и материалов.
Лаборатория должна иметь комнату-термостат с температурой 36,5—37°, (рефрижераторы с температурой от 4 до 0°, а для некоторых целей с более низкими температурами (от —20° до —70°, помещение для центрифуг (необходимы центрифуги до 3000 об/мин). Желательны, а иногда необходимы скоростные центрифуги с рефрижераторами (20 000—30 000 об/мин). Специальная моечная комната должна обеспечивать мойку соответствующей стеклянной посуды. Помимо механической очистки, здесь широко применяют химическую очистку, так как стеклянная посуда должна быть безупречно чистой, с нейтральным pH. Помимо слабощелочных растворов, в которых кипятят посуду, применяют последующую обработку кислотами (соляная кислота 1 : 10, азотная кислота). Перед высушиванием посуду промывают в проточной и дистиллированной воде (8, 23).
Просмотр культур производят, как правило, при комнатной температуре под обычным микроскопом; все шире и шире применяется фазоконтрастная, а также люминесцентная микроскопия. В обиход таких лабораторий начинает входить электронная микроскопия, что крайне необходимо при изучении методом культуры тканей тех или других вопросов вирусологии. Хорошо оборудованная лаборатория, помимо установок для микрофотографии, имеет цейттраферные установки для микрокиносъемок.
Солевые растворы и питательные жидкости
Солевые растворы. Эти растворы широко применяют для различных манипуляций как для приготовления культур и их пассирования, так и для разведения питательных сред. В настоящее время имеется большое количество так называемых сбалансированных солевых растворов, состав которых постепенно усложняется, что объясняется прогрессом знаний о неорганических составных частях тканевых жидкостей тела человека, особенно кровяной сыворотки, и о состоянии их ионизации в присутствии белков плазмы. Такой солевой раствор должен отвечать следующим условиям: он должен содержать необходимые ионы неорганических соединений в количествах, близких к имеющимся в кровяной сыворотке, а также 0,1—0,2% глюкозы; солевой раствор должен обладать достаточной буферностью, его pH должен быть близким к pH крови (7,2—7,4); он должен быть изотоничен жидкостям организма.
Не так давно солевым раствором, даже сравнительно простого состава, как, например, жидкостью Рингера, широко пользовались для промывки тканевых культур при смене жидкой фазы во флаконах Карреля и считали возможным держать культуры в таком растворе в течение получаса и больше. Однако в настоящее время было показано вредное действие чистых солевых растворов на клеточные элементы культур ввиду извлечения ими из клеток необходимых компонентов. Поэтому не рекомендуется держать в солевых растворах кусочки тканей и особенно клеточные взвеси больше 15 минут, а в тех случаях, когда это необходимо, следует прибавлять к солевому раствору 5—10% кровяной сыворотки.
Так как сбалансированные солевые растворы применяются в смеси с другими ингредиентами, входящими в состав питательной среды (сыворотка, эмбриональный экстракт, плазма), различия в их составе не имеют существенного значения для успешности культивирования тканей млекопитающих и человека. Однако при использовании жидкости Хенкса приходится уделять большее внимание поддержанию pH среды, так как она содержит меньше буферных соединений, чем жидкость Эрла. Для культивирования тканей холоднокровных применяют солевые растворы другого состава с иным осмотическим давлением (этот вопрос здесь не рассматривается).
Из различных солевых растворов, применяемых в практике тканевых культур, мы приведем состав лишь наиболее употребительных, а именно растворов Тироде, Гейев, Эрла и Хенкса.
Раствор Тироде. Готовят два раствора, которые стерилизуют отдельно путем автоклавирования в течение 30—40 минут под давлением 1,5 атм (количества приводятся без кристаллизационной воды). При охлаждении растворов их сливают вместе и добавляют из стерильных ампул такое количество 10—25% раствора глюкозы, чтобы ее конечная концентрация равнялась 1—2 г на 1 л смеси. Через полученный раствор продувают смесь воздуха с 5% объемным содержанием углекислоты через стерильную трубку с ватным предохранителем. Такое продувание необходимо для подкисления жидкости, сделавшейся щелочной в результате автоклавирования. Затем раствор разливают в ампулы по 10 мл.
Феноловый красный является индикатором и указывает на pH жидкости: продувание надо производить до тех пор, пока фиолетовый цвет раствора начнет переходить в желтоватый. Дистиллированная вода должна быть перегнана дважды, а по данным некоторых авторов, — трижды. Имеются и другие прописи для приготовления жидкости Тироде, например, стерилизация путем пропускания через фильтр вместо автоклавирования.
Кровяные сыворотки. Кровяную сыворотку применяют как необходимую часть питательных сред при использовании самых различных методик культивирования тканей. Только в самое последнее время пытаются применять сложные синтетические среды, не содержащие нативных белков. Обычно пользуются сыворотками таких животных, как лошади, кролики, морские свинки. Для культивирования тканей человека обычно применяют человеческую сыворотку.
Сыворотка должна быть прозрачной, не содержать эритроцитов и лейкоцитов и быть бедной жиром, поэтому кровь у животных следует брать натощак. Следует использовать животных молодого возраста. Некоторые авторы рекомендуют вместо сыворотки, полученной из крови человека, приготовлять сыворотку из плацентарной крови. Кровь берут асептично в стеклянные сосуды и после образования свертка помещают на ночь в холодильник при температуре около 0°. Сыворотку разливают в ампулы из нейтрального стекла. Лошадиная сыворотка должна быть подвергнута некоторой обработке, прежде чем ее можно пускать в работу, так как иначе она дает осадки и тормозит рост культур. Обычно после разливки в ампулы последние помещают в холодильник при температуре ниже 0°, где сыворотка замерзает и хранится в таком состоянии в течении нескольких месяцев. Перед употреблением ее оттаивают и центрифугируют, причем выпадает довольно обильный осадок из грубодисперсных белков.
Кровяная плазма. Плазма в классических методиках считалась обязательной составной частью питательных сред, однако в новейших методиках, особенно при культивировании клеточной взвесью, питательные среды не содержат свернувшейся плазмы. Свернувшаяся плазма является твердым субстратом для роста тканей, особенно соединительной (фибробластов) и нейроглиальной. Берут ее у животного или из сердца, из крупной артерии, или из вены. Чаще всего для этой цели используют птиц — кур или гусей, у которых кровь берут из сонной артерии через канюлю либо из шейной или подкрыльцовой вены — шприцем. Для предохранения от свертывания можно пользоваться антикоагулянтами, например, гепарином, или собирать кровь в охлажденные парафинированные пробирки для центрифуги.
Кровь центрифугируют при 3000 оборотах в течение 20 минут, плазму отсасывают и разливают в небольшие парафинированные пробирки. Хранят при температуре около 0°. Плазма птиц дает прозрачный и прочный сверток, тогда как плазма млекопитающих и особенно человека при свертывании оказывается менее стойкой, легче подвергающейся разжижению, а также менее прозрачной, вследствие более грубых нитей фибрина. Во избежание мутности плазмы из-за жировых капель рекомендуется не кормить животных за сутки до взятия крови, а давать им лишь воду для питья. Не рекомендуется также брать плазму у кур перед и во время носки яиц, так как в свертке легко выпадают соли кальция, что вредно отражается на росте культур.
Асцитическая жидкость человека. Эту жидкость получают от больных с выраженным асцитом. В каждом отдельном случае необходимо выяснить пригодность асцитической жидкости для замены человеческой кровяной сыворотки, так как некоторые асцитические жидкости обладают токсическим действием на культуры тканей. Жидкость должна быть освобождена от форменных элементов и выпадающих в ряде случаев нитей фибрина. Ее разливают в ампулы, в которых она может храниться неопределенно долгое время.
Сывороточный ультрафильтрат. Получается путем фильтрации сыворотки через коллодийные мембраны; содержит только мелкие молекулы. В ряде случаев сывороточным ультрафильтром можно пользоваться в течение некоторого времени вместо цельной сыворотки, особенно при культивировании ожиревших культур, которые при этих условиях теряют избыток жировых включений.
Тканевые экстракты. В старых методиках, как правило, применяется эмбриональный куриный экстракт, который обладает выраженным стимулирующим действием на
рост и размножение клеток и легко приготовляется. Для этой цели обычно используют 11-дневных куриных эмбрионов, которых стерильно извлекают из яиц и после освобождения от оболочек гомогенизируют с одинаковым объемом солевого раствора путем растирания в ступке с песком или в пробирке стеклянной палочкой о стенку последней, либо, что лучше и быстрее, в специальных аппаратах, например, измельчителях. Надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования, считают эмбриональным соком, разбавленным известным количеством солевого раствора. Чаще готовят 50% эмбриональный экстракт и добавляют его в таком количестве, чтобы по отношению ко всем ингредиентам питательной среды его .концентрация составляла 10%.
По предложению Гейев, широко применяется коровий эмбриональный экстракт. Для этого 2—3-месячные эмбрионы, получаемые на бойне вместе с маткой, стерильно извлекают, измельчают до кашицеобразного состояния, разводят равным количеством сбалансированного солевого раствора, разливают по пробиркам и дважды центрифугируют при 3000 оборотах в мин. Надосадочную жидкость разливают по пробиркам и сохраняют на холоду, лучше в замороженном состоянии, при температуре от —10° до —50°. В таком состоянии все экстракты могут храниться, не теряя своей активности, в течение ряда месяцев. Другой способ, применяемый для длительного хранения экстрактов — это их лиофильная сушка.
Помимо указанных выше экстрактов применяют и экстракты, приготовленные из человеческих эмбрионов, эмбрионов некоторых млекопитающих (кролик, морская свинка), а также экстракты из некоторых органов (костный мозг, лимфатические узлы, селезенка), которые обладают выраженным стимулирующим действием на рост культуры тканей. В последнее время в лаборатории Эрла доказано, что ультрафильтраты куриного эмбрионального экстракта также обладают стимулирующим рост действием и с успехом могут заменять обычные эмбриональные экстракты. Это имеет существенное значение для практики тканевых культур, так как дает гарантию стерильности получаемых экстрактов. В самое последнее время показано, что экстракты и ультрафильтраты из цельных не насиженных яиц (без скорлупы) обладают таким же ускоряющим рост действием на культуры определенных видов клеток (клон клеток L) как и обычные эмбриональные куриные экстракты (культура мышиных фибробластов, полученная путем размножения одной изолированной клетки из длительно растущих культур).
Синтетические питательные среды. Изучение условий питания культивируемых клеток, проводимое в широких масштабах, главным образом в лаборатории Эрла, показали возможность длительного культивирования тканей и клеток в средах, состоящих из точно определимых в химическом отношении ингредиентов без примеси нативных белков. Однако длительное культивирование в таких упрощенных питательных средах возможно только по отношению к некоторым клеточным колониям, хорошо растущим вне организма, как, например, штаммы L и S (культура печеночных клеток от эмбриона мыши).
Широкое распространение получила среда 199, особенно для культивирования в культуре тканей некоторых вирусов, например вируса полиомиелита. Эта среда состоит из большого количества компонентов и приготовление ее представляет довольно сложную процедуру. Помимо обычных солей, входящих в состав сбалансированных солевых растворов, она содержит группу аминокислот, группу витаминов В, жирорастворимые группы, смесь витаминов С, витамин Е, фолиевую кислоту, биотин, аденин, пурины и пиримидины, аденозинтрифосфат, раствор железа, адениловую кислоту, рибозу и дезоксирибозу, глютамин, глюкозу.
Кроме того, к ней прибавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин) для предохранения от случайной инфекции. Первоначально предложенная в 1950 г. эта среда подвергается в процессе испытания изменениям. Так, например, солевой раствор Эрла в последней модификации Моргана, Камбелла и Мортона заменен сбалансированным раствором Хенкса, который благодаря уменьшенному содержанию кальция и бикарбоната является более стойким и имеет pH около 7,2. Эта модифицированная среда, получившая название смеси 150, дает возможность культивировать клетки в течение 35—45 дней без какого-либо прибавления питательных сред, содержащих нативные белки. Культивирование в течение такого времени возможно и для тканей, взятых непосредственно от животного.
Эрлом и его сотрудниками предложена питательная среда из химически определенных соединений, не содержащих белка.
В состав этой среды входят примерно те же компоненты, что и в среду 199 или 150. Она имеет также очень сложный состав и содержит 71 ингредиент. Мы не будем останавливаться на подробностях относительно состава я способа приготовления всех этих сложных синтетических сред, тем более что в ходе исследований они постепенно изменяются. Таким образом, вопрос о культивировании тканей в безбелковой, с точно определенным химическим составом среде благодаря интенсивной разработке его в ряде лабораторий близится к разрешению.
Первичные посадки и пассажи
Материал для опытов культивирования получают при соблюдении асептических условий путем вырезания соответствующих кусочков тканей, например кусочков опухолей, с обращением внимания на сохранение клеточных элементов в жизнеспособном состоянии. Ткань для культивирования должна быть лишена некротических участков, стерильна и достаточно богата теми клетками, которые предполагается культивировать. Вырезанные у животного кусочки помещают в жидкость Тироде или какую-нибудь другую аналогичную жидкость, налитую в луночку стекла с углублением или в чашку Петри. При применении обычной методики культивирования кусочки разрезают острым режущим инструментом (например, глазным скальпелем) на мелкие частицы размером 1—3 мм в диаметре, которые и помещают в соответствующую питательную среду.
Старые методики первичных посадок кусочками органов, взятыми у животных или у человека, в последнее время пытаются заменить более совершенными методиками получения по возможности однородных клеточных взвесей, из которых готовят культуры. Промежуточной стадией к этому является посев очень измельченных комочков ткани, приготовленных при помощи специальных режущих аппаратов. Ножницы для этой цели менее пригодны, так как при разрезаний ими повреждаются клетки.
В последнее время для получения клеточных взвесей разработана методика трипсинизации. Готовят 0,25% раствор трипсина в буферном солевом фосфате (pH 7,5) и стерилизуют его фильтрацией через свечу. Кусок опухолевой ткани или какого-либо другого органа, а также части эмбриона измельчают ножницами на кусочки диаметром в 4—5 мм и затем повторно (по 10 минут) обрабатывают раствором трипсина при 37°; при этом применяют специальный аппарат, в котором взвесь взбалтывается при помощи специальной мешалки. Так как трипсин освобождает лишь поверхностные слои клеток, которые переходят в жидкость, приходится повторять эту операцию 8—10 раз; при этом надосадочная жидкость после оседания кусочков повторно декантируется и заменяется свежим раствором трипсина. Собранные порции клеточной взвеси центрифугируют, освобождают промывкой от трипсина, ресуспендируют в питательной жидкости и после подсчета числа клеток в 1 мл переносят в точно дозированном количестве в питательную среду, разлитую в соответствующую посуду. Эта методика дает возможность получать массы живых клеток без примеси стромы. Она применяется для приготовления как первичных, так и пассажных культур.
Пассирование культур, т. е. пересадку уже росших культур, производят через различные сроки — от 48 часов до нескольких месяцев в зависимости от применяемой методики культивирования, скорости роста культур и поставленных задач. Обычно такое пассирование имеет целью не только поддержание данной культуры, но и размножение ее. Приготовление указанных субкультур различно в зависимости от методики культивирования. По старым классическим методикам с ростом ткани в свертке фибрина при пассировании вырезают кусочек ткани вместе с так называемой зоной роста, а в ряде случаев разрезают культуры на 2—4 части, которые и пересаживают в новую питательную среду. При использовании более новых методик, с культивированием без применения плазмы и размножением клеток на поверхности стекла или целлофана, клетки отделяют от твердого субстрата механически при помощи тока жидкости или специально сконструированного в виде изогнутой пластинки инструмента, либо обрабатывают трипсином, а полученную клеточную суспензию переносят в свежую питательную среду в новую посуду.
Основные методики культивирования
Культивирование в висячих каплях. Это — наиболее старая методика культивирования, утратившая в настоящее время самостоятельное значение, однако применяемая для некоторых специальных целей (изучение клеток при сильных увеличениях микроскопа, в том числе для цейттраферной микрокиносъемки, для постановки различных гистохимических реакций, которые необходимо наблюдать непосредственно под микроскопом и т. п.). Особенно хорошо удается культивирование в висячих каплях быстрорастущих тканей, как, например, эмбриональных, некоторых опухолевых тканей.
Для этого кусочки ткани 1—3 мм в поперечнике помещают на слюдяную пластинку или покровное стекло в распределенную равномерным слоем по поверхности смесь кровяной плазмы и обычно равного количества разведенного эмбрионального экстракта. После свертывания пластинку опрокидывают над соответствующего диаметра луночкой большого предметного стекла и герметически заклеивают по краям слоем парафина. Пассажи производят через 2—6 дней; культуру с зоной роста вырезают острым ножом, иногда разрезают на две и больше частей, которые переносят в новую питательную среду такого же состава.
Для более медленно растущих культур лучше применять методику подкармливания, например по способу А. А. Максимова. Для этого культуры помещают на небольшие слюдяные пластинки в твердую фазу из кровяной плазмы с добавлением соответствующей жидкости, слюдяную пластинку прикрепляют капелькой солевого раствора к слюдяной пластинке более крупного размера и к большому покровному стеклу, которое опрокидывают над луночкой предметного стекла. Часто поверх твердой фазы наносят капельку жидкой фазы из разведенного эмбрионального экстракта, кровяной сыворотки или их смеси. Через несколько дней слюдяную пластинку с культурой споласкивают в солевом растворе и производят подкармливание, т. е. наносят свежую каплю питательной жидкости на поверхность твердой фазы, а в случае ее разжижения прибавляют небольшое количество плазмы. Пассирование производят после нескольких подкармливаний, когда зона роста достигла достаточных размеров.
Флаконы Карреля с применением свернувшейся плазмы. Это — одна из наиболее распространенных методик культивирования тканей, которая не утратила до настоящего времени своего значения. Однако она начинает уступать более новым методикам приготовления однослойных культур на твердом субстрате — стекле или целлофане без свернувшейся плазмы.
Из различных флаконов, в свое время предложенных Каррелем и отличающихся по своим размерам, наличию или отсутствию двух отверстий, наиболее широко применяются в настоящее время флаконы типа D диаметром 3—4 см, высотой в 1—1,5 см с одной боковой косо поставленной полой трубкой. Флаконы делают из нейтрального стекла или пирекса и стерилизуют сухим жаром. Культуры можно помещать прямо на дно флакона или на вводимые в него пластинки слюды целлофана. Последние вырезают по размерам дна флакона, очищают от жира и тщательно промывают, стерилизуют в автоклаве. Их вводят пинцетом во флакон перед посадкой в виде свернутой трубочки — пластинки целлофана быстро расправляются на дне флакона после смачивания 1—2 каплями солевого раствора. При пассировании культур, а также для фиксации и окраски пластинки целлофана извлекают из флакона пинцетом, переносят в чашку Петри и подвергают соответствующей обработке.
В зависимости от культивируемого объекта и поставленной задачи питательная среда может быть различной по своему составу. Принято говорить о двух фазах — твердой, состоящей из свернувшейся плазмы, эмбрионального экстракта и солевого раствора, и жидкой, состоящей из солевого раствора и кровяной сыворотки. При культивировании тканей человека берут человеческую кровяную сыворотку, тканей мелких грызунов (мышей и крыс) — лошадиную сыворотку. Количественное содержание этих компонентов может довольно сильно варьировать без особого значения для роста культур. При культивировании таких опухолей человека, как саркомы, меланобластомы, опухолей нервной системы, опухолей мышечной ткани, а также соединительной ткани человека, мы применяем следующий состав питательной среды. Во флакон Карреля (тип D) диаметром в 3,5 см вводят твердую фазу, состоящую из 0,5 мл жидкости Тироде или Эрла и 0,5 мл куриной плазмы, для свертывания которой добавляют несколько капель эмбрионального экстракта. В качестве эмбрионального экстракта мы применяем 2—4 капли коровьего эмбрионального экстракта. Жидкую фазу (0,5 мл жидкости Тироде или Эрла и 0,5 мл человеческой сыворотки) прибавляют после внесения во флакон посадочного материала и свертывания твердой фазы, для чего флакон лучше помещать на несколько часов в термостат при температуре 37°. Если реакция среды оказывается сдвинутой в щелочную сторону, что узнается по окраске жидкости (индикатор феноловый красный), то во флакон вводят смесь воздуха с 5 об.% углекислоты.
Инструментарий, применяемый при первичной посадке и пассажах, состоит из скальпеля, катарактального ножа, 2 пинцетов — одного анатомического, другого с тонкими браншами, лучше изогнутыми (глазной пинцет), копья, пеана и лезвиев для бритья. Последние удобно применять в качестве режущего инструмента при приготовлении кусочков для посадки и для вырезания разросшихся культур из свертка плазмы. Лезвие зажимают пеаном или в специальную рукоятку. Инструменты стерилизуют, опуская их в 95% этиловый спирт с последующим проведением над пламенем горелки и ополаскиванием в солевом растворе.
Питательные среды для культур берут из соответствующих пробирок или ампул при помощи пипеток, которые снабжены колпачками для насасывания жидкости. Четыре пипетки помещают в пробирки, поставленные косо под углом в 45° в специальной установке, сделанной из никелированной жести. Можно пользоваться градуированными пипетками, если необходимо соблюдать точность в составе питательной среды. Однако более удобны обычные пипетки, причем количество жидкости отсчитывают каплями. При этой методике жидкую фазу для быстро растущих культур сменяют два раза в неделю, для медленно растущих можно ограничиться одним разом. Свежую порцию жидкой фазы вводят во флакон сразу после отсасывания прежней жидкой фазы без промывки солевым раствором. В некоторых случаях рекомендуется оставлять около 25% старой фазы, производя лишь частичную ее замену.
Пассирование культур в случае их быстрого роста и при стремлении размножить культивируемый материал производят один раз в неделю, иногда даже чаще, однако в большинстве случаев между пассажами имеется более длительный интервал — 2—3 недели. Пассирование культур производят таким образом, что пластинку целлофана или слюдяные пластинки извлекают из флакона в луночку большого предметного стекла, затем острым режущим инструментом делают 4 разреза в наружных частях зоны роста так, чтобы удалить всю старую плазму и по возможности сохранить зону роста, которая хорошо видна простым глазом; можно употреблять и лупу. Тогда культура имеет вид квадрата, который разрезают на 2 или 4 части, переносимые в новый флакон в твердую фазу. Эта методика дает возможность следить за ростом культуры ежедневно, для чего флакон в опрокинутом состоянии помещают на столик микроскопа и рассматривают при слабых увеличениях (50—100 раз).
Флаконы Карреля и в настоящее время широко применяются для поддержания некоторых длительно растущих in vitro (иногда в течение многих лет) культур тех или других нормальных или опухолевых тканей, так как благодаря своему устройству они достаточно гарантируют от случайной воздушной инфекции во время смены жидкой фазы и при пассировании. Для предотвращения инфицирования культур во флаконы Карреля в жидкую фазу вводят 50—100 единиц пенициллина и 50—100 мкг стрептомицина на 1 мл. В этих дозах названные антибиотики не оказывают неблагоприятного влияния на рост культур. В случае все же развившейся инфекции, что легко узнается по помутнению жидкой фазы или по появлению колоний микробов в твердой фазе, в ряде случаев удается освободиться от микробного загрязнения путем воздействия антибиотиками, но уже примененными в больших дозах — до 1000 единиц на 1 мл. Помимо пенициллина и стрептомицина или смеси их, в нашей лаборатории начали с успехом применять колимицин. Во избежание инфицирования грибками с хорошим эффектом применяют микостатин — 0,01 мг или 20—50 единиц на флакон.
В последнее время в лаборатории Эрла начали применяться флаконы, обозначаемые буквой Т, несколько других размеров и форм, чем флаконы Карреля. В зависимости от размера площади дна флакона ставится соответствующая цифра, обозначающая площадь в квадратных сантиметрах. Таким образом, появились флаконы Т-9, Т-15, Т-30, Т-60. Впрочем эти флаконы нашли применение главным образом для культивирования тканей и клеток без твердой фазы.
Метод культивирования с применением свертка фибрина, как указано выше, не потерял своего значения и до настоящего времени, так как благодаря особенностям строение твердой фазы из тонких переплетающихся нитей фибрина создаются особенно благоприятные условия для роста некоторых тканей не в виде отдельных клеточных комплексов, а в виде взаимно связанной системы, в которой клеточные элементы благодаря своим отросткам образуют как бы единое целое. По особенностям роста таких культур удается определять тканевой тип растущей ткани, изучать явления ее дифференцировки и дедифференцировки, взаимоотношения тканей при их совместном культивировании.
Культивирование во вращающихся пробирках. Эта методика была предложена уже больше 10 лет назад Гейем и нашла широкое применение. Ее преимуществом перед ранее предложенными способами культивирования является создание более благоприятных условий для питания клеток, так как при вращении горизонтально расположенной пробирки, на стенках которой располагаются культуры, последние то омываются питательной жидкостью, то находятся в соприкосновении с воздухом. Длина пробирок может быть различная — от 10 до 20 см и больше; точно также и ширина пробирок может быть различной. Пробирки делаются из нейтрального стекла и стерилизуются сухим жаром. Как первичную посадку, так и пассажи можно выращивать непосредственно на стекле или подкладывать пластинки целлофана.
В первоначальной методике Гейя мелко измельченную ткань вносили пипеткой в пробирку с некоторым количеством плазмы, смешанной с солевым раствором и эмбриональным экстрактом. Пробирку приводили во вращательное движение в горизонтальной плоскости. Кусочки распределялись на всей поверхности пробирки и благодаря свертыванию плазмы фиксировались на определенных местах.
Для вращения пробирок применяют специально устроенные барабаны, ось которых образует около 15° с горизонтальной плоскостью, что предохраняет от затекания жидкой фазы культур в отверстие пробирки, которая закрывается гуттаперчевой пробкой или резиновым колпачком. Количество твердой и жидкой фаз сильно варьирует в зависимости от размеров пробирки и количества посаженного материала.
Для пробирки размером 15 X 1,5 см при посеве измельченных кусочков ткани количество твердой фазы равняется 0,2—0,5 мл, жидкой фазы — около 3 мл. Состав жидкой фазы может быть различным, но в общем он не отличается, от того, который применяется при культивировании во флаконах Карреля. Пропускание газовой смеси в ряде случаев рекомендуется для создания соответствующего pH среды. В стандартных установках скорость вращения барабана обычно равняется 6—10 об/час. Такой барабан может вращать одновременно сотни пробирок. Имеются данные, заставляющие полагать, что скорость вращения барабана, обычно устанавливаемая на 6—10 об/час, является недостаточной. Помимо культивирования клеток и тканей в среде, содержащей сверток фибрина, в настоящее время эта методика применяется и для культивирования клеточной взвеси, растущей непосредственно на стекле.
Культивирование в губчатой массе. Попытка приблизить условия роста и размножения клеток к условиям целого организма вызвала появление некоторых методик, в которых рост культур происходит в каналах и щелях специально приготовленной основы. В качестве последней используют перфорированный целлофан, который можно употреблять в виде несколько наложенных друг на друга пластинок; между ними помещают взвесь клеток или измельченные кусочки ткани. Более широкое применение нашла методика, предложенная Лейтоном, где рост культур происходит в целлюлозной губке, в среде из свернувшейся плазмы.
Однослойные культуры. Культивирование клеточной взвесью на поверхности твердого субстрата (стекла или целлофана) находит в настоящее время все более широкое применение как для поддержания определенных клеточных штаммов, так и для получения массовых культур. Эта методика оказалась особенно ценной для учета влияния состава питательной, среды и различных факторов на пролиферацию клеток, так как она позволяет точно учитывать прирост или убыль клеточных элементов культуры путем прямого сосчитывания их числа. При этой методике клетки размножаются только в одной плоскости в отличие от культур в свертке фибрина. Хотя возможность культивирования клеток в одной жидкой среде уже давно доказана, однако разработка этой методики произведена главным образом в лаборатории Эрла в последние 6—7 лет. В первых опытах клеточные взвеси готовились из исходного материала путем пропускания измельченной ткани, которая должна быть богата клетками (например, эмбриональной), через 2 сита — с более крупными и более мелкими отверстиями. Однако предпочтительнее работать с трипсином, так как пропускание через поры сита вызывает травматизацию многих клеток и применимо только к очень мягким тканям.
Посев клеточной взвеси можно делать в самую различную посуду (флаконы Карреля, Паркера, флаконы Т-9, Т-15, Т-30, Т-60, пробирки, матрацы разных размеров и т. п.) непосредственно на стекло, которое должно быть тщательно очищено, или на целлофановую пластинку. Очень важное значение имеет правильное соотношение между количеством посаженных клеток и количеством питательной среды. В зависимости от размера клеток того или другого штамма нужное количество их на 1 мл питательной среды выражается следующими числами: при среднем размере диаметра клеток в 7 m требуется 2 600 000, в 20 m — 320 000 и в 40 m — 80 000. Установлено, что при малом содержании клеток на 1 мл питательной среды размножение задерживается. Так, в лаборатории Эрла найдено, что при культивировании во флаконах Т-12 мышиные фибробласты штамма L, полученного из одной клетки, размножаются при содержании их от 100 000 до 3 млн. клеток на флакон. Высчитано, что 6—8 млн. клеток на культуру являются максимальными для флакона Т-12 при данных условиях выращивания. При такой концентрации объем питательной среды на клетку приблизительно равен 0,0003—0,0004 мм3.
В качестве питательной жидкости применяют различные среды, преимущественно синтетические, например, среду 199, как правило, с некоторой примесью нативной сыворотки. Пассирование культур производят путем химической обработки, лучше всего трипсином или путем механического отслаивания клеточного пласта и получения из него путем повторного пипетирования (повторные насасывания клеточной взвеси в пипетку и выдувания ее) или на специальных мешалках клеточных взвесей, которые после отмывания от старой питательной среды переносят в новые питательные среды. При этом с помощью смесителя и счетной камеры определяют число клеток в 1 мл данной порции. Таким образом устанавливают, на сколько нужно развести новой питательной средой клеточную взвесь, чтобы получить оптимальные условия для размножения клеток.
В некоторых случаях, особенно при посеве клеточной суспензии из исходного материала, можно рекомендовать смачивать поверхность стекла или целлофана разведенной куриной плазмой, которую перед введением клеточной взвеси тщательно отсасывают. Этим достигается лучшее прикрепление клеток с момента их посева.
Приготовление клеточной взвеси из плотных образований, как, например, многих раковых опухолей человека, представляет значительные трудности и в должной мере не разработано. Были предложены некоторые технические приемы для эксплантации таких тканей и опухолей. Л. Ф. Арендаревский предложил применить культивирование кусочков тканей, фиксировав их в щелях пластинок целлофана, которые плавают в питательной жидкости.
Культивирование клеток во взвешенном состоянии. В последнее время разрабатываются методики для культивирования клеток, находящихся во взвешенном состоянии в питательной среде. Хотя этот вопрос находится еще в сравнительно начальной стадии разработки, тем не менее определенные клеточные популяции можно культивировать в таких условиях, причем происходит значительное увеличение числа клеток. В первых опытах Эрл с сотрудниками выращивал клетки линии L в специальных вращающихся трубках со скоростью от 300 до 2400 оборотов в час.
В более поздних опытах из лаборатории Эрла приводятся данные о культивировании клеточными взвесями таких культур, как клон (под клоном понимают культуру, полученную из одной изолированной клетки какого-либо культивируемого in vitro штамма) L-929, клон 469 печеночного эпителия мыши и штамм HeLa карциномы шейки матки человека. Питательная среда состояла из 30% лошадиной сыворотки, 20% куриного эмбрионального экстракта в разведении 1 : 1 и 50% сбалансированного солевого раствора с прибавлением 0,1% метилцеллюлозы.
При культивировании штамма HeLa вместо лошадиной сыворотки употреблялась человеческая. В отдельных случаях количество глюкозы доводилось до 2,0 и больше на 1 л питательной среды. Культивирование производилось в измененных эрленмейеровских сосудах или плоскодонных флаконах, которые помещали в специальный шюттель-аппарат. Скорость движения такого аппарата доходила до 13 600 колебаний в час. Размеры флаконов или колб были от 1 до 1,5 л. Для лучшего снабжения клеток кислородом питательную жидкость постоянно обогащали воздухом, содержащим 5% по объему углекислоты. При этих условиях удалось получать очень массивные культуры. Так, в опытах с культурой 939 штамма HeLa после 39-дневного культивирования получена культура, росшая во флаконе емкостью 1,5 л, с содержанием клеток к концу культивирования в 5,9 блн., что составляет 23,6 г веса клеток. Этому методу нужно приписать большую будущность, так как он дает возможность получать значительное количество живых клеток животных и человека.
Измерение роста культур
Рост культур определяется увеличением числа и массы живых клеток, однако точное измерение такого увеличения представляет значительные трудности. Между тем для многих исследований учет скорости роста культур является основным критерием. Идеальным способом учета роста культур был бы такой, где определение роста не влекло бы за собой гибели культуры и где, следовательно, можно было бы производить повторные исследования на одной и той же культуре в течение всего эксперимента. К сожалению, такой методики пока нет, а все применяемые в настоящее время способы определения страдают теми или другими недостатками.
Измерение площади зоны роста культуры. Это — один из самых старых способов для суждения о влиянии тех или других факторов на скорость роста культур. Он применим для культур, растущих в свернувшейся плазме и пассируемых с помощью кусочков ткани. О росте таких культур судят по увеличению зоны роста, которую можно легко измерить тем или другим способом. Можно ограничиться измерением при помощи окулярного микрометра 2 перпендикулярных друг к другу диаметров культуры и вычислить площадь, приняв форму культуры за круглую.
Более точным является обведение наружных контуров зоны роста культуры путем проекции ее с последующим вычислением площади планиметром. Для этой цели можно пользоваться проекционным фонарем или рисовальным аппаратом с применением очень небольших увеличений. Так как имеется зависимость между величиной культивируемого кусочка и величиной зоны роста, рекомендуется брать отношение между площадью зоны роста и площадью посаженного кусочка ткани по формуле А - Б / Б, где А — вся площадь, занимаемая культурой, Б — площадь посаженного кусочка. Здесь, следовательно, определяется не абсолютная величина зоны роста, а лишь ее прирост на единицу площади посаженного кусочка ткани. Таким образом, дается ответ, во сколько раз увеличилась площадь, занимаемая зоной роста, по сравнению с площадью кусочка.
При постановке таких экспериментов, где определяется действие тех или других факторов на рост культур, о чем судят по размерам зоны роста, требуется соблюдать ряд
условий: 1) нужно иметь в достаточном количестве однородные, по клеточному составу хорошо растущие культуры, которые при каждом пассаже с разрезанием материнской культуры на 2 субкультуры дают одинаково интенсивный рост при культивировании их в одной и той же питательной среде; 2) размер пассируемых культур должен быть по возможности одинаковым, так как иначе будут значительные колебания величины зоны роста, особенно при определении их относительной площади; 3) не рекомендуется брать культуры, которые разжижают фибрин; 4) для получения более достоверных данных в эксперимент нужно брать 15—25 пассажных культур, которые до этого культивировались в лаборатории в течение ряда месяцев, в крайнем случае были проведены, через 5—7 пассажей.
При этом каждую культуру разрезают на 2 половинки, из которых одну пересаживают в обычную для нее питательную среду, вторую — в среду, где ее подвергают воздействию того или другого агента. Контуры посаженных кусочков ткани обводят указанным выше способом сейчас же после свертывания плазмы, контуры зоны роста — смотря по задачам исследования или однократно, когда рост достиг максимального (через 5—7 дней во флаконах Карреля) или несколько раз. Полученные данные обрабатывают методом вариационной статистики.
Указанная методика вычисления зоны роста применима главным образом для культур фибробластов и некоторых опухолей животных и человека, особенно сарком. Недостатком ее является то, что невозможно решить, какую роль в увеличении зоны роста играет миграция клеток из посаженного кусочка в зону роста и какую — их размножение. Кроме того, здесь не принимается во внимание толщина зоны роста, которая может быть очень различной в зависимости от характера растущей ткани, и не учитываются процессы дегенерации и гибели клеток. Наконец, наружные контуры зоны роста могут в отдельных случаях быть нечеткими, трудно определимыми, особенно при большой подвижности клеток.
Определение митотического коэффициента. Митотический коэффициент выражает числовое отношение между числом делящихся клеток в единице площади зоны роста культуры и общим числом клеток в этой же площади. Обычно его определяют на фиксированных и окрашенных препаратах, что является существенным недостатком этого способа, так как одна и та же культура может быть использована для этой цели только один раз. Подвергают микроскопическому исследованию 4 квадранта наружной части зоны роста и подсчитывают число митозов на 1000 клеток. Определяют, в каких- фазах деления находятся клетки, что имеет важное значение для решения вопроса о том, имеется ли нарушение какой-либо фазы митоза.
К недостаткам метода нужно отнести игнорирование состояния деления клеток в более центральных участках культуры, непринятие в расчет амитозов, а также времени митотического деления и интеркинеза. Наконец, здесь совершенно не учитывается отмирание клеток, что, конечно, может сильно сказаться на интенсивности роста культур.
Подсчет клеточных ядер. Эта методика, разработанная в лаборатории Эрла, основана на возможности выделения ядер культивируемых клеток, растущих на твердом, субстрате без фибрина, под действием 2% уксусной кислоты. Полученную с помощью смыва в определенном количестве кислоты ядерную взвесь окрашивают кристаллическим фиолетовым и подсчитывают общее число ядер в камере, употребляемой для счета красных и белых кровяных телец в гематологии. В настоящее время методика применяется в лаборатории Эрла, тогда как в других лабораториях производят подсчет числа живых клеток после обработки трипсином.
Определение числа клеток в культуре. Это — одна из более совершенных методик, дающая точное представление о клеточной популяций культур. Клеточную взвесь получают с помощью трипсина или версена. Способ применим как к культурам, растущим в плазме, так и к культурам, растущим на твердом субстрате или в виде клеточной суспензии. Эта методика нашла широкое применение, так как определение числа клеток в единице объема питательной среды имеет существенное значение для успешности культивирования.
О способе применения трипсина для получения клеточной взвеси упоминалось в соответствующей статье. Здесь мы укажем лишь на способ получения клеточной взвеси для счета клеток в случае культивирования в плазматическом свертке. Раствор трипсина должен покрывать культуры вместе со свертком фибрина на высоту 2—5 мм. Переваривание происходит при pH 7.4 - 7.6 при комнатной температуре или в термостате. Рекомендуется приводить в движение жидкость тем или другим способом, а также освободить сверток от поверхности стекла. Переваривание свертка и освобождение клеток требует от 15 до 15 минут. Не рекомендуется дожидаться переваривания в центральной части культуры, так как периферические клетки могут быть при этом повреждены энзимом. Для этих целей употребляется 0,5% раствор трипсина.
Помимо этих наиболее распространенных методик определения роста культур имеются еще и другие, основанные на изучении химического состава культивируемой ткани (определенно общего белка) и на вычислении сухого веса культур. Применяется также определение дезоксирибонуклеиновой кислоты. Попытка судить об интенсивности роста культур на основании потребления ими глюкозы и образования молочной кислоты оказалась неудачной, так как изменение гликолиза и дыхания не всегда идет параллельно с изменением интенсивности роста культур.
Морфологическое изучение культур
Изучение морфологии культур производят как в живом состоянии, так и на фиксированных и окрашенных препаратах. При изучении культур, растущих в свертке фибрина во флаконах различного образца, приходится применять слабое увеличение микроскопа (80—120 X). Однако и при этом увеличении можно хорошо разобраться в общей структуре зоны роста, а также в некоторых деталях строения клеток. Здесь особенно помогает применение фазоконтрастной микроскопии, которая дает возможность получать прекрасные микрофотоснимки живых культур. Более детальное изучение возможно при культивировании по методу висячей капли, а также при перенесении пластинок с культурами в специальные камеры, покрытые тонким стеклом или слюдой.
При этих условиях можно применять сильное увеличение, вплоть до иммерсии. На таких живых культурах произведено много интересных исследований с прижизненной окраской их нейтральными и кислыми красками, - а также изучалось непосредственное действие тех или других факторов на клеточные элементы культур. Особенно ценные и наглядные результаты дает применение микрокиносъемки и флюоресцентной микроскопии, которая позволяет отличить живые клетки от поврежденных и некротизированных. Ценным объектом для изучения клеток в живом состоянии является однослойная культура, растущая на твердом субстрате без свертка фибрина, когда клетки лежат в одной плоскости в виде очень тонкого слоя уплощенных элементов. Изучение цитологии живых клеток особенно удобно производить на таких культурах.
Для изучения фиксированных и окрашенных культур, как правило, готовят тотальные препараты. Однако более толстые культуры в случае, когда необходимо изучить морфологию центральных участков зоны роста и морфологию посаженного кусочка ткани, разлагают на срезы после фиксации и заключения в целлоидин или парафин. Срезы проводят по возможности параллельно плоскости зоны роста. Это совершенно необходимо при применении некоторых непрозрачных матриксов для культивирования, как, например, целлюлозной губки.
При приготовлении тотальных препаратов выбирают культуры с малым количеством свернувшейся плазмы или однослойные культуры. Перед фиксацией рекомендуется поместить культуры в термостате на 20—30 минут в солевом растворе, который несколько раз сменяют, удалив предварительно жидкую фазу культур. Таким путем можно предохранить от образования осадков в результате фиксации. В качестве фиксаторов применяют различные, употребляемые в гистологической технике растворы, как жидкость Карнуа, формалин, ценкерформол, фиксаторы с осмием и т. п. Более сложные и дорогие фиксаторы применяют при специальных исследованиях. В нашей лаборатории для обычных исследований широко пользуются фиксацией по А. Л. Шабадашу.
Для окраски препаратов можно применять самые различные красители, распространенные в гистологической технике. Особенно употребительны окраски гематоксилином по Караччи, железным гематоксилином по Вейгерту, Гайденгайну, гематоксилином Гарриса и т. п. В ряде случаев применяют дополнительные окраски кислыми красками, чаще всего эозином. Для гематологических исследований часто пользуются окраской азур-эозином, по Май-Грюнвальду — Гимза и т. п. Для специальных исследований применяется различная обработка препаратов, например для выявления жиров, гликогена, а также различные методики гистохимических исследований.
Изучение под электронным микроскопом цельных клеток культуры тканей требует некоторых специальных приемов культивирования на коллоидных мембранах, которые и наносят с распластанными на них клетками после соответствующей фиксации, лучше всего осмием, на сетку электронного микроскопа. Изучение таких цельных клеток позволяет видеть структурные особенности периферической части клетки, тогда как ядро не пробивается потоком электронов. Поэтому одна эта методика без изучения тончайших, специально приготовленных срезов является недостаточной.
ПРИЧИНЫ И СИМПТОМЫ
